紀順師，葉長蕓

單增李斯特菌是一種革蘭陽性、兼性厭氧的食源性細菌[1]。該菌感染可引起李斯特菌病，主要癥狀為敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等，病死率高達20%～30%[2]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)鑒定方法是進行細菌鑒定的“金標準”[3]，標本中李斯特菌的檢測均需通過2次增菌、選擇性培養(yǎng)基分離和生化鑒定，整個過程需要5～7 d才能完成，耗時長[3]。雖然現(xiàn)有核酸檢測方法能在數(shù)小時內完成目的基因的擴增和檢測，但也存在一些不足。PCR方法需經(jīng)過擴增、電泳以及凝膠成像等操作，耗時2～3 h且對儀器設備要求高，不適用于現(xiàn)場快速檢測[4]。Real-time PCR方法能對擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測且不需要電泳和凝膠成像，但對儀器設備要求高且儀器價格昂貴[5]。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術和多交叉置換擴增(MCDA)技術克服了以上劣勢[6]，在Bst酶的作用下，只需在某一恒定溫度(通常為60 ℃～65 ℃)下恒溫反應1 h就可完成核酸擴增過程，擴增結果可通過染料顏色、濁度、電泳和膠體金標記試劑條等多種形式進行判斷，對實驗儀器的要求低且耗時少[7]。

本實驗對文獻報道的針對單增李斯特菌特異基因lmo0733檢測的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA 4種檢測方法的特異性、靈敏度進行比較，并應用于模擬單增李斯特菌污染標本和市場采集的豬肉樣本的檢測，優(yōu)選出一種特異性好、靈敏度高、快速、高效，能應用于現(xiàn)場檢測的方法，為肉制品單增李斯特菌的快速檢測及分離鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實驗菌株 本實驗選用了43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌，其中單增李斯特菌參考菌株EGD-e用于比較方法的靈敏度，菌株信息見表1。

表1 本實驗所使用的菌株
Tab.1 Bacterial strains used in this study

菌株血清型菌株菌株來源菌株數(shù)量L.monocytogenens1/2aEGD-eATCC151772ATCC1Isolated strainsICDC101/2bBAA-2658ATCC1Isolated strainsICDC51/2c51779ATCC1Isolated strainsICDC53a51782ATCC1Isolated strainsICDC103bIsolated strainsICDC24a19114ATCC14b19115ATCC14c19116ATCC14d19117ATCC14e19118ATCC1710890NCTC1L.ivanoviiUBAA678ATCC1Isolated strainsICDC5L.innocuaUBAA680ATCC1Isolated strainsICDC10表1(續(xù))菌株血清型菌株菌株來源菌株數(shù)量L.grayiU25402ATCC1L.seeligeriU35967ATCC1L.welshimeriU35897ATCC1Isolated strainsICDC2Streptococcus suisUReference strainsICDC1S. faecalisUR. strainsICDC1S. oralisUR. strainsICDC1Enterobacter cloacaeUR. strainsICDC1S. pneumoniaeUR. strainsICDC1Salmonella paratyphiUR. strainsICDC1shigella dysenteriaeUR. strainsICDC1EnteropathogenicUR. strainsICDC1E. coliEnterotoxigenicUR. strainsICDC1E. coliEnteroaggregativeUR. strainsICDC1E. coliEnteroinvasiveUR. strainsICDC1E. coliEnterohemorhagicUR. strainsICDC1

aU，未知血清型；bATCC，美國模式培養(yǎng)物集存庫；NCTC，國家標準菌庫；ICDC，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所。

1.1.2試劑與儀器 FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養(yǎng)基(英國OXOID公司)；腦心浸液(北京陸橋技術有限公司)；細菌基因組提取試劑盒Bacteria Gene DNA kit(北京康為世紀生物科技有限公司)；2×T5 Super PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術公司)；Premix Ex TaqTM II、 DL2000 DNA Marker(大連寶生物公司)；Loopamp○RDNA反應試劑盒與Loopamp○R熒光檢測試劑(北京葵沫生物科技有限公司)；核酸恒溫擴增試劑盒(北京甄敏生物科技有限公司)；引物合成由北京奧科生物技術公司完成。Rotor-Gene Q real-time PCR system (QIAGEN Inc, Germany) ；凝膠成像系統(tǒng) GEL Doc2000(美國Bio-rad公司)；Loopamp○R實時濁度儀LAG320C(榮研生物科技中國公司)。

1.1.3DNA模版的制備 實驗菌株(表1)按照試劑盒說明書提取核酸，溶于100 μL Elution buffer中。實際豬肉樣本核酸提取步驟如下：取1 mL豬肉樣本Fraser增菌培養(yǎng)物，13 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入200 μL無菌去離子水重懸，金屬浴100 ℃加熱10 min，13 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA模板-20 ℃保存。

1.2 方 法

1.2.1引物設計 本研究中針對單增李斯特菌的特異基因lmo0733的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測引物參考相關文獻[7-9]，引物序列見表2。

1.2.2特異性驗證 43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌(表1)用于驗證傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的特異性，每種方法每個反應體系均加1 μL核酸作為模板，4種方法的具體操作步驟見參考文獻[7-9]。

1.2.3靈敏度比較 將試劑盒提取的單增李斯特菌參考株EGD-e的DNA進行倍比稀釋(10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、0.1 fg)，用于比較傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測下限，每種方法均加1 μL倍比稀釋的核酸作為模板，且每個稀釋度至少重復實驗3次。

表2 本研究所使用的引物
Tab.2 Primers used in this study

方法引物序列(5′-3′)長度參考來源普通PCRFCGCAAGAAGAAATTGCCATC 20nt[8]RTCCGCGTTAGAAAAATTCCA 20ntReal-time PCRFAATGCTTTATTGGCTATTTGTCTCG 25nt[9]RACTCCGATAACGCTAGTTTCAGG23ntProbeFAM-TGTGTGCCGTTATAGCAATAATTTCTGCG-BHQ-1LAMPF3AAATAGTCCTTACTTAGGTTGGGAT 25nt[9]B3CAGTAATTTTGAAGCCTGACTCATC25ntFIPCGGTGCTAATCTGACAAACAACCATTA-TAGTGATCCTGAAAC-TAGCGTT49merBIPATCCTTATAGGAGGAGTCGTTGGAACC-CAAAAGCATCAAACATAG-TACG49merLFCAAATGTATGAAAAGCTACTCCG23ntLBTTCTAACGCGGAAGAACGTATAA23ntMCDAF1AAGGACTTTCGCAAGAAGA19nt[7]CP1AGGAACTGACAGTCCTTGCTATCAAAC-TGAATGTGGTGC39merC1AGGAACTGACAGTCCTTGCT20ntD1CCCATTTAGAGATTGTTTGTC 21ntR1GGAGATTAACATATCGGAATC21ntR2GAAGTGCTTGAAACACCAGT20ntD2CAAAGGTTGATGATGTAAAAGC22ntC2CACTTTGCTTGGAGAAACTGTTATG25ntCP2CACTTTGCTTGGAGAAACTGTTATGAA-GTTTATAATCTC-CAGTTTTTCGG 50merF2GGCGGTCTTTCTTTGAGC 18nt

1.2.4模擬樣本的制備 市場購買的新鮮豬肉作為原始模擬樣本，稱取25 g采用歐標方法(ISO11290-1:2017)進行單增李斯特菌的分離培養(yǎng)鑒定，單增李斯特菌檢測陰性的豬肉樣本被認為無單增李斯特菌污染，可用于制備模擬樣本。挑取參考株EGD-e單菌落接種到5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min增菌直至OD600達到0.6，吸取100 μL增菌液到900 μL PBS緩沖液中進行連續(xù)10倍稀釋。分別對不同濃度稀釋液進行菌落計數(shù)，得到100 μL增菌液中含有的單增李斯特菌數(shù)量，取100 μL稀釋菌液與單增李斯特菌檢測陰性的25 g豬肉樣本混合制備成模擬樣本，模擬樣本中單增李斯特菌的終濃度分別為5×100CFU/25 g～5×108CFU/25 g。

1.2.5模擬樣本靈敏度檢測 制備的模擬樣本用50 mL PBS緩沖液浸泡反復揉捏幾次，將PBS沖洗液12 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留沉淀，按照試劑盒說明書提取核酸。應用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法對模擬樣本進行檢測，評價每種方法的檢測靈敏度。

1.2.6歐標方法(ISO11290-1:2017)檢測豬肉樣本中的單增李斯特菌 某豬肉零售市場不同攤位采集的50份豬肉樣本，取25 g豬肉樣本加入到225 mL的Half Fraser增菌液中，30 ℃，220 r/min，增菌24 h。然后取0.1 mL一次增菌培養(yǎng)物加入到10 mL Fraser 增菌液中，37 ℃，220 r/min，增菌36～48 h。用接種環(huán)取3環(huán)二次增菌產(chǎn)物，接種至李斯特菌顯色固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫孵育24～36 h，平板上挑取5個單增李斯特菌典型或可疑菌落，涂布于BHI平板進行純培養(yǎng)，用于單增李斯特菌鑒定。

1.2.7核酸檢測方法檢測豬肉樣本增菌液培養(yǎng)物

取1 mL Fraser培養(yǎng)液中的增菌培養(yǎng)物提取DNA，13 000 r/min離心3 min，棄上清，加入200 μL去離子水重懸，100 ℃金屬浴加熱10 min，13 000 r/min離心3 min，取上清液作為模板，同時使用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法進行單增李斯特菌核酸檢測。

1.2.8歐標檢測方法和4種核酸檢測方法對豬肉樣本分離單增李斯特菌檢出率比較 以“金標準”中歐洲標準培養(yǎng)方法得到單增李斯特菌陽性的樣本作為參照，比較4種核酸檢測方法與歐洲標準方法的單增李斯特菌陽性檢出率及一致性情況。

2 結 果

2.1引物驗證 傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測引物通過NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進行特異性比對，結果顯示4種核酸檢測方法的引物(表2)均為單增李斯特菌特異。

2.2特異性的驗證 43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌(表1)用于傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的特異性驗證，結果顯示4種方法均能特異性擴增單增李斯特菌。

2.3靈敏度結果 如圖1所示，對于單增李斯特菌參考株EGD-e倍比稀釋的核酸，傳統(tǒng)PCR方法的檢測下限為10 pg/反應；Real-time PCR和LAMP方法的檢測下限均為100 fg/反應，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的100倍；MCDA方法的檢測下限為10 fg/反應，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的1 000倍，并且MCDA方法對于濃度為10 fg的核酸30 min內即可檢測到。

2.4模擬樣本檢測靈敏度結果 如圖2所示，傳統(tǒng)PCR方法對于模擬污染豬肉樣本的檢測能力為5×103CFU/反應；Real-time PCR和LAMP方法檢測模擬樣本的能力達到5×102CFU/反應，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的10倍；MCDA方法的檢測下限為5×101CFU/反應，靈敏度為傳統(tǒng)PCR方法的100倍。因此，MCDA方法的對模擬樣本的檢測比其它3種核酸檢測方法靈敏。

(A) 普通PCR方法的檢測下限；(B) Real-time PCR方法的檢測下限；(C) LAMP方法的檢測下限，(D) MCDA方法的檢測下限。M，DL2000bp，DNA Marker。圖1 單增李斯特菌EGD-e菌株核酸檢測下限 Fig.1 LOD of four methods for nucleic acid of L. monocytigenes EGD-e

(A)普通PCR方法的檢測下限；(B)Real-time PCR方法的檢測下限；(C) LAMP方法的檢測下限，(D) MCDA方法的檢測下限。M，DL2000bp，DNA Marker。圖2 4種核酸檢測方法對模擬樣本核酸的檢測下限Fig.2 LOD of four nucleic acid detection methods for artificial contaminated samples

2.5歐標方法對市場豬肉樣本中李斯特菌的檢測結果 通過對純培養(yǎng)的疑似單增李斯特菌菌落的鑒定，市場采集的50份豬肉樣本中有13份樣為單增李斯特菌陽性，分離率為26%。

2.6核酸檢測方法對豬肉樣本增菌液培養(yǎng)物的檢測結果 應用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法對50份豬肉樣本的二次增菌培養(yǎng)物核酸的檢測結果如表3所示。傳統(tǒng)PCR方法檢測到11份豬肉樣本單增李斯特菌核酸陽性，Real-time PCR只檢測到4份單增李斯特菌陽性樣本，LAMP檢測到15份樣本為單增李斯特菌陽性，MCDA方法檢測到18份樣本為單增李斯特菌陽性。其中MCDA方法檢測到的18份陽性樣本包含了其它3種方法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的陽性樣本。

隨后將MCDA方法檢測陽性而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測陰性的5份豬肉樣本的Fraser增菌液，使用另一種李斯特菌選擇培養(yǎng)基-阿洛糖增菌培養(yǎng)基[10]，進行再次增菌分離培養(yǎng)。吸取1 mL Fraser增菌液到5 mL阿洛糖增菌液，35 ℃、220 r/min增菌30 h，涂布CM1080選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取疑似菌落進行鑒定，結果5份樣本均分離到單增李斯特菌。因此，對50份豬肉樣本的檢測，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的單增李斯特菌陽性率為26%，MCDA方法的陽性率為36%。

3 討 論

單增李斯特菌是一種重要的食源性細菌，廣泛分布于自然界，常見于生冷食品。食用被單增李斯特菌污染的食品可導致嚴重的李斯特菌病，單增李斯特菌的發(fā)病率雖低但病死率高達20%～30%。因此，樣本中單增李斯特菌的快速檢測對于病例確診和及時治療很重要。

以往單增李斯特菌核酸檢測的靶基因通常是hlyA、actA、prfA等[11-12]，但有文獻[8,13]報道這些基因不僅存在于單增李斯特菌，也在其他李斯特菌屬細菌(如伊氏李斯特菌、希爾李斯特菌)中存在。目前l(fā)mo0733是被認為是單增李斯特菌特有的基因，因此本研究對以該基因為靶標的核酸檢測方法進行了比較。

單增李斯特菌常用的核酸檢測方法主要包括傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR，以及恒溫擴增為基礎的LAMP方法、MCDA方法。傳統(tǒng)PCR方法是實驗室最常用的核酸擴增檢測方法，但擴增產(chǎn)物需經(jīng)凝膠電泳成像才能讀取擴增結果，整個過程耗時約2～3 h；Real-time PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎上，增加熒光基團和熒光檢測裝置，從而實現(xiàn)實時檢測擴增結果，不需要凝膠電泳成像，但需要精密的儀器設備，價格較為昂貴；恒溫擴增方法能夠在恒溫條件下1 h內能完成核酸的擴增，對儀器的要求較低，擴增結果可通過可視化等多種方式判讀。

表3 分離培養(yǎng)方法和四種核酸檢測方法對50份豬肉樣本單增李斯特菌分離結果
Tab.3Listeriamonocytogenesisolation results of culture method and four nucleic acid methods on 50 pork samples

樣本編號分離培養(yǎng)法普通PCR方法Real-time PCR方法LAMP方法MCDA方法1++++2++++5+++++9++10++21+++++37++++39+++42+++44+++++52++++54++++63++++66++++71+82+++++89+90+共計131141518分離率26%22%8%30%36%

注：傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和四種分子診斷方法檢測均為陰性樣未列出本；+：表示陽性結果。

本文應用的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA 4種核酸檢測方法均能準確檢測單增李斯特菌。傳統(tǒng)PCR方法對50份生肉樣本的分離，核酸檢測陽性的樣本為11份，而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法結果為陽性的有13份，可能由于傳統(tǒng)PCR方法檢測靈敏度有限，增菌液中核酸量小于閾值導致假陰性結果；Real-time PCR方法對模擬樣本的檢測下限為5×102CFU/反應，但實際樣本中只檢測到4份，可能與水煮法制備核酸法導致二次增菌液培養(yǎng)物中某些物質未能去除，從而影響Real-time PCR方法的核酸擴增效率或熒光的檢測有關；LAMP方法和MCDA方法在模擬樣本和實際樣本檢測中都有很好的特異性和靈敏性，LAMP方法檢測到15份單增李斯特菌陽性生肉樣本，而MCDA方法檢測到18份單增李斯特菌陽性樣本，提示生肉樣本的檢測中MCDA方法比LAMP方法更為靈敏。

本研究證實多交叉置換擴增(MCDA)方法比其它3種核酸檢測方法更為快速、靈敏且實用性強，在單增李斯特菌監(jiān)測和單增李斯特菌疫情暴發(fā)時，應用MCDA方法可對增菌液進行快速篩檢，減少分離培養(yǎng)及鑒定的時間(通常為32～72 h)，節(jié)省人力和成本。因此，MCDA方法可作為快速篩檢的分子診斷方法應用于肉制品樣本中單增李斯特菌的檢測。

利益沖突：無