曹 宇楊 洋王飛雪馬麗娜韋 云 劉美霞李 浩 張宇忠 裴 卉

酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)是指由于長期飲酒導致慢性腦器質(zhì)性損害而出現(xiàn)記憶缺損并伴有一種或一種以上認知功能受損的精神行為異常[1]。研究顯示，酒精中毒已成為誘導癡呆發(fā)病的重要因素，癡呆病人中的酒精濫用者比例高達9%～22%，而酒精濫用者中癡呆的患病率高達10%～24%，明顯高于一般人群中癡呆5%的患病率[2]。目前AAD的治療以神經(jīng)營養(yǎng)劑及戒酒干預為主，尚缺乏有效和特異治療藥物及方法[3-4]。中醫(yī)藥由于其多靶點的作用途徑，在治療上凸顯出一定優(yōu)勢。

中醫(yī)學對于酒精的認識可溯及《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·厥論》中提道：“夫酒氣盛而慓悍”；《靈樞·營衛(wèi)生會》曰：“酒者熟谷之液也，其氣悍以清”；《靈樞·論勇》亦曰：“酒者，水谷之精，熟谷之液也，其氣慓悍”。這些論述指出酒精慓悍性烈，易于耗傷氣血。《素問·厥論》中記載：“酒入于胃，則絡脈滿而經(jīng)脈虛，脾主為胃行其津液者也，陰氣虛則陽氣入，陽氣入則胃不和，胃不和則精氣竭，精氣竭則不營其四肢也”?；诖死碚?，全國名老中醫(yī)周文泉教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)擬定了參麻益智方。本研究通過建立酒精性癡呆大鼠模型，探討參麻益智方防治AAD大鼠的療效及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡清潔級雄性Wistar大鼠30只，體重220 g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京) 2016-0002，使用基礎(chǔ)飼料適應性喂養(yǎng)1周，溫度(23±2 )℃， 濕度(50±10)%，每日明暗交替12 h。實驗條件及實驗過程均符合國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2 藥物 參麻益智方組成：人參、天麻、鬼箭羽、川芎，按3∶3∶3∶2的比例配制。藥物制備由中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院藥劑科完成。按照人與大鼠用藥劑量換算方法取各藥共5 200 g，純凈水浸泡30 min，入砂鍋文火煎煮30 min，倒出藥汁，加純凈水2次煎煮20 min。合并兩次藥汁，紗布過濾后，置于100 ℃恒溫水浴箱濃縮至100%，每克濃縮膏即含生藥1 g，放于4 ℃冰箱保存。

1.1.3 試劑 兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體(批號ab89443)、兔抗大鼠血紅素加氧酶-1(HO-1)多克隆抗體(批號ab13243)均購自Abcam公司，辣根酶標記的羊抗兔 IgG 抗體(批號ZB2301)購自中杉金橋有限公司，組織還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號A006-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號A003-2)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號A001-3)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及造模 將大鼠隨機分為5組：空白(Control)組、模型(Model)組、參麻益智方低劑量(SMYZD-L)組、參麻益智方中劑量(SMYZD-M)組、參麻益智方高劑量(SMYZD-H)組，每組6只。給藥1個月后參照文獻[5]中方法造模：Model組、SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠分別灌胃25%酒精5 g/(kg·d)，連續(xù)灌胃10 d，Control組予以等量蒸餾水灌胃。

1.2.2 給藥方法 SMYZD-L組給予藥物3.3 g/kg灌胃，SMYZD-M組給予藥物6.6 g/kg灌胃，SMYZD-H組予藥物16.5 g/kg灌胃，Control組、Model組給予等量蒸餾水灌胃。每日灌胃1次，連續(xù)給藥1個月。

1.2.3 觀察指標及方法

1.2.3.1 水迷宮行為學檢測 定位航行實驗，檢測大鼠從入水至尋找到平臺的時間，即逃避潛伏期，并以此作為衡量大鼠學習和空間記憶能力的標準。每只大鼠依次面對池壁，每天分別從4個方位入水進行訓練。每次訓練間隔為15～20 min。記錄大鼠逃避潛伏期，若大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺，則引導大鼠至平臺停留10 s，潛伏期記為90 s。大鼠逃避潛伏時間越長，說明大鼠空間學習能力越差?？臻g探索實驗，實驗第5天，將第一象限平臺撤去，將大鼠依次從第一象限對側(cè)(最遠側(cè))面對池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在原平臺位置的穿臺次數(shù)，以及在原平臺象限的游泳時間和路程。穿臺次數(shù)越少、在目標象限停留的時間和路程越短，說明大鼠的空間記憶能力越差。

1.2.3.2 樣本制備 行為學實驗結(jié)束后，次日進行腦組織取材。麻醉、取血后，在低溫環(huán)境下快速取出大鼠的全腦組織。隨后用手術(shù)刀快速將全腦組織以矢狀縫為界，一分為二。取一半于低溫條件進行海馬和皮層的分離，將分離后的海馬組織-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ａ硪话肽X組織進行切片HE染色。

1.2.3.3 大鼠腦組織HE染色 將固定后的腦組織常規(guī)石蠟包埋，切片；二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水后蘇木精染色5 min；自來水沖洗干凈后，鹽酸乙醇中分色，水洗藍化；酒精伊紅染色液染色2～3 min；常規(guī)脫水后進行透明處理，中性樹脂封固。10×20倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬組織CA1區(qū)病理形態(tài)。

1.2.3.4 海馬組織中GSH、MDA含量及SOD活力測定 取各組凍存的腦組織，準確稱取組織重量，按重量與體積的比例，加入9倍的生理鹽水制成組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液嚴格按照試劑盒說明書要求測定GSH、MDA含量及SOD活力。蛋白定量采用BCA蛋白定量法。

1.2.3.5 免疫印跡法(Western blot)測定海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達 取各組大鼠海馬組織裂解、勻漿后取上清液，BCA蛋白定量法進行蛋白定量后-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。實驗當日根?jù)目的蛋白分子量，依次配制10%分離膠，5%濃縮膠。將組織蛋白從-20 ℃冰箱取出，解凍，上樣量為5 μL。上樣結(jié)束后進行電泳，將電源調(diào)至恒壓60 V，約20 min后觀察溴酚藍到達濃縮膠下端，則改為恒壓90 V，直至溴酚藍到達分離膠的底部則電泳結(jié)束。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中依次放置海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿(膠正膜負)，用轉(zhuǎn)移夾夾緊放至電轉(zhuǎn)槽，以恒流100 mA轉(zhuǎn)印100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜取出，放入5%BSA中搖床孵育30 min，加入一抗(預實驗確定抗體稀釋比例均為1∶2 000)，搖床孵育5 min，放入4 ℃冰箱。次日取出PVDF膜，加入TBST洗膜，9 min，5次；再于5%BSA溶液中孵育30 min，加入二抗(1∶10 000稀釋)，繼續(xù)在搖床上孵育90 min，孵育后TBST洗膜，9 min，5次。二抗孵育搖洗結(jié)束后進行顯影。對掃描結(jié)果采用Image J進行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮行為學檢測結(jié)果

2.1.1 定位航行實驗 采用重復測量設計的方差分析，各組大鼠在 1 d、2 d、3 d、4 d的平均逃避潛伏期比較，與ModeC組比較，Control組、SMYXD組大鼠平均逃避潛伏期明顯縮短，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；事后分析各時間點比較，第1天各組潛伏期數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第2天Model組大鼠逃避潛伏期與Control組、SMYZD組比較明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第3天、第4天SMYZD-H大鼠逃避潛伏期與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與Model組比較明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明大鼠的學習記憶能力有所改善。詳見圖1、表1。

圖1 AAD大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期

組別只數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天Control組663.28±15.7019.23±10.151)7.33±3.101)6.67±4.141)Model組662.54±11.8656.30±9.4733.98±9.7222.69±3.70SMYZD-L組663.88±11.6427.20±14.921)18.29±8.4716.56±13.10SMYZD-M組660.46±7.9327.12±15.191)15.80±5.4518.76±14.22SMYZD-H組659.38±19.1928.78±15.841)12.41±7.711)11.22±7.061)

與Model組同期比較，1)P<0.05

2.1.2 空間探索實驗 與Control組相比，Model組的穿臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比及第一象限停留路程百分比均減少(P<0.05)；與Model組相比， SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組穿臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比及目標象限停留路程百分比均呈上升趨勢，其中SMYZD-H組穿臺次數(shù)及目標象限停留時間百分比明顯增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖2。

組別只數(shù)穿臺次數(shù)(次)目標象限停留時間百分比(%)目標象限停留路程百分比(%)Control組63.83±0.981)31.41±4.741)33.62±5.031)Model組61.83±0.7520.29±1.4123.56±2.44 SMYZD-L組62.83±0.9828.15±5.471)25.25±2.26SMYZD-M組62.50±1.0525.81±4.9627.38±5.83SMYZD-H組63.83±0.751)25.81±4.961)31.13±6.64

與Model組同期比較，1)P<0.05

圖2 參麻益智方對AAD大鼠空間探索實驗結(jié)果

2.2 大鼠海馬組織病理改變 Control組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)形態(tài)正常，錐體細胞層排列緊密，均勻而整齊，染色均勻；Model組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)形態(tài)明顯改變，錐體細胞排列松散、稀疏、紊亂，細胞變性、壞死、脫落明顯；SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)形態(tài)趨于正常，錐體細胞層排列尚緊密、均勻，可見細胞少許脫落，與Model組差異明顯。詳見圖3。

圖3 AAD大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色(10×20)

2.3 海馬組織中GSH、MDA含量及SOD活力 與Control組比較，Model組大鼠海馬組織中GSH含量顯著降低(P<0.05)，與Model組比較，SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠海馬組織中GSH含量呈上升趨勢，且SMYZD-M組、SMYZD-H組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Control組比較，Model組大鼠海馬組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)，與Model組比較，SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠海馬組織中MDA含量呈下降趨勢，且SMYZD-H組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Control組相比，Model組大鼠海馬組織SOD活力明顯降低且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Model組相比，SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組海馬組織中SOD活力呈現(xiàn)上升趨勢。說明參麻益智方可以提高海馬組織中GSH含量、SOD的活力和降低MDA的含量，且高劑量組效果要優(yōu)于低劑量組。詳見表3、圖4。

組別只數(shù)GSH[μmol/(g·prot)]MDA[nmol/(mg·prot)]SOD[U/(mg·prot)]Control組6 24.51±12.411) 2.70±1.031) 2.61±0.611)Model組6 12.30±2.81 8.89±3.97 1.40±0.28SMYZD-L組6 15.37±1.42 4.84±1.54 1.49±0.43SMYZD-M組6 21.73±7.911) 3.49±0.54 1.94±0.29SMYZD-H組6 26.17±16.521) 2.79±1.191) 2.36±0.66

與Model組比較，1)P<0.05

與Model組比較，*P<0.05

2.4 海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達 與Control組相比， Model組大鼠海馬組織中Nrf2總蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，與Model組比較，SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠海馬組織中Nrf2總蛋白的表達呈上升趨勢，且SMYZD-M、SMYZD-H有顯著性升高(P<0.05)；與Control組相比， Model組大鼠海馬組織中HO-1蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，與Model組比較，SMYZD-L組、SMYZD-M組、SMYZD-H組大鼠海馬組織中HO-1蛋白的表達呈上升趨勢，且與SMYZD-H組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖5。

組別只數(shù)Nrf2HO-1Control組41.03±0.061)0.68±0.131)Model組40.81±0.060.47±0.05SMYZD-L組40.85±0.100.49±0.09SMYZD-M組40.95±0.041)0.54±0.04SMYZD-H組40.98±0.061)0.67±0.111)

與Model組比較，1)P<0.05

與Model組比較，*P<0.05

3 討 論

我國是一個酒文化歷史悠久的國家，酒的品種繁多。酒由水谷釀造而成，少飲可防病治??；肆意痛飲則酒毒傷人。歷代醫(yī)家對酒性的認識也很統(tǒng)一，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就記載道“酒性苦熱”，巢元方的《諸病源候論》記載：“酒性有毒，而復大熱，飲之過多，故毒熱氣滲溢經(jīng)絡，浸溢臟腑，而生諸病也?！本C上可以看出，酒性溫熱，味甘、苦辛，有毒，入心、肝、肺、胃經(jīng)，飲之過多，則導致疾病發(fā)生。酒精性癡呆就是飲酒過度導致的疾病中的一種。

酒精性癡呆為一種全身性疾病，其基本病機為髓海不足，神機失用。酒精性癡呆的病因主要是脾胃虛弱，酒入于胃中之后，不能將其及時運化輸布，酒氣停聚中焦，一方面進一步損傷脾胃，造成精氣與陰液耗竭；另一方面蘊濕化熱，形成濕熱毒邪，如此反復惡性循環(huán)，以致脾胃衰敗，陰精生化無源，陰不制陽，肝陽上亢，化風生火，風陽上擾清竅，神明不清而成呆病。因此，酒精性癡呆的病位在腦，與脾、胃、心、腎功能失調(diào)密切相關(guān)。該病的病機為本虛標實，本虛為陰精、氣血虧虛；標實為肝陽上亢，瘀血阻竅。針對以上病因病機應補益脾胃之氣、活血祛瘀。正如《景岳全書·雜證謨》言：“有可愈者，有不可愈者，亦在乎胃氣元氣之強弱?！币虼耍狙芯窟x用參麻益智方，該方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎四味藥物組成，方中以人參為君，具有大補元氣、補脾益胃、生津、安神增智之功，針對酒精損傷脾胃、耗氣傷津而設，且對酒精性癡呆有益智養(yǎng)神之效；天麻為臣，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功，針對酒精陽熱傷陰，陰不制陽而設，病邪久居，不斷損氣耗血，“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡”，故以鬼箭羽為佐，具有行血通絡、散瘀之功；川芎為使，兼引經(jīng)藥，具活血化瘀，行氣之功，其為血中之氣藥，可載諸藥直入血分，又善行頭面，可載諸藥直入腦竅；諸藥配伍具有益氣活血增智之功。

現(xiàn)代醫(yī)學認為酒精在代謝過程中會形成過氧化物，長期飲酒會導致機體氧化增強，抗氧化能力下降，損害神經(jīng)細胞，進而造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害[6]。學習、記憶功能損害是慢性酒精性腦損傷的神經(jīng)行為學變化的早期重要癥狀之一[7]，而海馬在學習記憶過程中充當了重要的角色。海馬富含神經(jīng)錐體細胞和神經(jīng)顆粒蛋白，是酒精最易受累的重要腦區(qū)之一[8]。

Morris水迷宮行為學檢測是海馬依賴的視空間學習記憶功能檢測的常用方法。本研究中，采用酒精灌胃誘導大鼠AAD的發(fā)生，結(jié)果顯示Model組大鼠Morris水迷宮潛伏期較Control組顯著延長(P<0.05)，穿臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比及目標象限停留路程百分比較Control組均下降(P<0.05)，提示大鼠的學習記憶功能受到損害。而給予參麻益智中藥灌胃后，潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿臺次數(shù)及目標象限停留時間百分比均顯著上升(P<0.05)，說明參麻益智方能有效改善AAD大鼠的學習記憶能力。從HE染色可以看出，Model組較Control組海馬CA1區(qū)椎體細胞減少，排列紊亂；而中藥干預后，錐體細胞數(shù)量增多，排列緊密，說明參麻益智方對AAD大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞具有保護作用。

機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，大量研究表明，大腦氧化應激過程中自由基的損傷在酒精依賴認知功能損害中起著非常關(guān)鍵的作用[9-13]。Nrf2是機體抗氧化應激的中樞調(diào)節(jié)者，在正常情況下，其在胞質(zhì)中被降解，不發(fā)揮生理作用，當其在體內(nèi)被有毒有害物質(zhì)激活后轉(zhuǎn)位進入細胞核，能與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合形成Nrf2-ARE信號通路，從而使下游一系列抗氧化物得以表達，主要包括過氧化氫酶(catalase，CAT)、SOD、GSH以及HO-1[14]。其中，HO-1是一個重要的對抗氧化應激反應的細胞保護酶。GSH是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[15]。SOD是重要的抗氧化酶之一，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是機體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶[16]。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基、酮基、羥基、羧基、氫過氧基等，引起細胞損傷。因而檢測MDA含量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度[17-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠海馬組織中Nrf2及HO-1蛋白表達、GSH含量、SOD活力較Control組均顯著降低(P<0.05)，MDA含量則顯著升高(P<0.05)，表明酒精可使大鼠海馬區(qū)氧化應激水平增強、抗氧化能力下降；而SMYZD組大鼠海馬組織中Nrf2及HO-1蛋白表達、GSH含量、SOD活力較Model組均顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，說明參麻益智方可上調(diào)AAD大鼠海馬組織Nrf2-ARE信號通路蛋白的表達，提高GSH含量、SOD活力，降低MDA含量，具有抗氧化的作用。

中藥復方參麻益智方可通過抗氧化應激發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減少認知損傷，改善AAD大鼠學習記憶功能。本課題組前期研究表明，參麻益智方能夠從多個靶點、多種途徑協(xié)同改善認知功能，其中，本研究對AAD大鼠海馬組織氧化應激方面進行了研究，而其在AAD中的其他神經(jīng)保護機制還有待于深入研究。