徐昕，呂勇剛，王磊，李信

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院（解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院）甲狀腺乳腺血管外科，西安 710032

乳腺癌是臨床上女性最常見的惡性腫瘤，威脅女性健康和生存[1-2]。已有的證據(jù)顯示，乳腺癌的發(fā)病率和病死率有逐年升高的趨勢[3]。乳腺癌的發(fā)病有一定的年齡偏向性，老年人是乳腺癌的高發(fā)人群，也是患者預(yù)后的重要因素[4]。胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞增殖相關(guān)生物大分子，其表達(dá)水平與惡性腫瘤細(xì)胞的多種病理過程相關(guān)，如增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等，且可作為腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、藥物療效評估及患者預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物[5]。扭曲蛋白TWIST也參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的病理過程，也是潛在的惡性腫瘤藥物治療的重要靶點(diǎn)，也可作為判斷患者預(yù)后的參考標(biāo)志物[6]。本研究分析TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者術(shù)后生存的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺血管外科2011年2月至2016年12月診治的80例老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌并行乳腺切除術(shù)患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，并符合中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2007版）[7]中關(guān)于老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)嚴(yán)重的代謝疾病患者；有嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙患者；并發(fā)其他惡性腫瘤患者。將此80例患者設(shè)為淋巴結(jié)陽性組，年齡62～71歲，平均（65.5±9.2）歲；Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期25例。另選取同期健康體檢者80例設(shè)為對照組，老年腋窩淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者80例設(shè)為淋巴結(jié)陰性組。3組患者平均年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有納入的研究對象或其家屬均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與方法

抽取空腹靜脈血，1000 r/min離心10 min后保存于4℃保藏箱待用。本研究中所有檢測項(xiàng)目均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法進(jìn)行。TK1蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Omega公司；Ki-67蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Abcam公司；惡性腫瘤相關(guān)物質(zhì)群（tumor supplied group of factors，TSGF）蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；TWIST蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Research and Developmen（tR&D）公司；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）蛋白檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司；Dickkopf相關(guān)蛋白 1（Dickkopf-related protein 1，DKK1）酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒購自美國Amresco公司。所有檢測的操作過程及操作條件均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測各組血清中TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白水平，與β-actin的比值為蛋白相對表達(dá)水平。TK1/β-actin＜0.50為“+”，0.50≤TK1/β-actin≤0.55 為“++”，TK1/β-actin＞0.55 為“+++”；TWIST/β-actin＜0.50為“+”，0.50≤TWIST/β-actin≤0.60為“++”，TWIST/β-actin＞0.60為“+++”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)-軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，采用Log-rank法進(jìn)行生存情況的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及 DKK1蛋白相對表達(dá)水平的比較

將淋巴結(jié)陰性組+淋巴結(jié)陽性組設(shè)為乳腺癌組。乳腺癌組患者 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且淋巴結(jié)陽性組患者 TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及 DKK1蛋白相對表達(dá)水平均高于淋巴結(jié)陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、表2）

表1 對照組與乳腺癌組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平的比較

表2 淋巴結(jié)陰性組與淋巴結(jié)陽性組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平的比較

2.2 不同臨床分期的腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平的比較

不同臨床分期的腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著患者臨床分期的增加，上述蛋白的相對表達(dá)水平增高（P＜0.05）。（表3）

2.3 不同TK1、TWIST水平的老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的生存情況比較

隨著TK1、TWIST水平的升高，老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的生存率逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、圖2）

表3 不同臨床分期淋巴結(jié)陽性組患者TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平的比較

圖1 不同TK1水平的老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的生存曲線

圖2 不同TWIST水平的老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的生存曲線

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率和病死率有逐年升高的趨勢，且是影響老年女性患者生活質(zhì)量和生存狀態(tài)的重要因素。乳腺癌患者在臨床上通常采用乳腺癌切除術(shù)治療，且已經(jīng)取得明顯的進(jìn)展。探索乳腺癌患者乳腺癌切除術(shù)后生存的相關(guān)生物大分子標(biāo)志物對臨床的早期診斷具有重要的參考意義。本研究在對TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者乳腺切除術(shù)后生存的關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組TK1、Ki-67、TSGF、TWIST、HIF-1α及DKK1蛋白相對表達(dá)水平均高于對照組，且淋巴結(jié)陽性組高于淋巴結(jié)陰性組。TK1及TWIST表達(dá)情況與老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者乳腺切除術(shù)后的生存有關(guān)。

TK1是參與了多種惡性腫瘤發(fā)病過程的生物大分子，也是評價(jià)惡性腫瘤患者預(yù)后情況的重要標(biāo)志物[7-8]。在分析尿路上皮腫瘤組織中TK1表達(dá)變化及意義的研究中發(fā)現(xiàn)，尿路上皮腫瘤組織中TK1表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)變化有助于判斷尿路上皮腫瘤的病理分級[9]。以往的研究也發(fā)現(xiàn)替吉奧對晚期乳腺癌患者血清TK1、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）的調(diào)控作用是其提高患者生活質(zhì)量，改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[10]。以往的研究也發(fā)現(xiàn)血清TK1在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌及健康人群中的表達(dá)存在明顯的差異，且與患者的臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)[11]。同時(shí)，血清中細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、TK1蛋白表達(dá)水平與肺癌復(fù)發(fā)呈明顯的正相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TK1蛋白表達(dá)水平與老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌發(fā)病有密切的關(guān)系。在以往的研究中證實(shí)TK1、Ki-67及TSGF在惡性腫瘤的發(fā)病中有一定的相關(guān)性[13-14]，本課題組在以后的研究中將進(jìn)一步分析3種蛋白在老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌發(fā)病及治療中的相關(guān)性，以期為臨床診斷提供更多的標(biāo)志物。TWIST蛋白是惡性腫瘤惡化轉(zhuǎn)移的參與蛋白分子，也是評價(jià)臨床腫瘤藥物治療效果的重要標(biāo)志物[15-16]。在研究轉(zhuǎn)錄因子TWIST基因慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建及其促進(jìn)乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-7上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)，TWIST蛋白參與了惡性腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[17]，且膀胱腫瘤組織及尿液標(biāo)本中TWIST基因的甲基化水平的異常也是膀胱腫瘤發(fā)病的重要因素[18]。在分析Twist表達(dá)與移行上皮腫瘤惡變及病理相關(guān)性的研究中也發(fā)現(xiàn)生物大分子Twist表達(dá)在移行細(xì)胞癌變過程中明顯升高,同時(shí)兩者共同參與移行細(xì)胞癌局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[19]。以往的研究也證實(shí)TWIST與大多數(shù)的惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，且TWIST基因甲基化是腫瘤發(fā)生的高危因素[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)TWIST水平越高的老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的生存率越低。HIF-1α是細(xì)胞增殖過程中表達(dá)增強(qiáng)的關(guān)鍵蛋白，且與腫瘤患者的生存質(zhì)量及生存期密切相關(guān)[22]，而DKK1也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[23]，與本研究結(jié)論一致。雖然本研究中證實(shí)上述蛋白與患者臨床分期有關(guān)，但鑒于研究的樣本量相對較少，為獲得更準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，在下一步的研究中課題組將進(jìn)一步增大研究樣本。因此，TK1及TWIST與老年腋窩淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者臨床分期有關(guān)，其水平與乳腺切除術(shù)后生存有關(guān)。