馬俊，蔣曉波，張曦，曾學(xué)明，胡兵，沈斌進(jìn)，王駿，朱潤(rùn)宇，姚林亞#

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬昆山市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科，江蘇 昆山 215300

2昆山市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 昆山 215300

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，常發(fā)生于前列腺外周帶的上皮細(xì)胞，發(fā)病率逐年遞增[1]。血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是由前列腺腺泡及導(dǎo)管上皮細(xì)胞分泌的絲氨酸蛋白酶。血清PSA高表達(dá)患者前列腺癌的發(fā)病率明顯高于低表達(dá)患者，但PSA的特異度相對(duì)較低，常需要進(jìn)行多項(xiàng)不必要的活檢，因此，前列腺癌的診斷迫切需要新型腫瘤標(biāo)志物[2]。前列腺癌抗原 3（prostate cancer associated 3，PCA3）基因是新型且理想的前列腺癌標(biāo)志物，血液、尿液和精液中均可檢測(cè)到PCA3的表達(dá)，對(duì)診斷前列腺癌的特異度較高，可避免一些不必要的有創(chuàng)檢查[3-5]。本研究分析尿PCA3mRNA和血清PSA表達(dá)水平，及其與腫瘤分化程度的關(guān)系，并探討前列腺癌患者尿PCA3表達(dá)水平升高的分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年1月至2017年8月昆山市中醫(yī)醫(yī)院收治的因血清PSA表達(dá)升高和（或）直腸指診異常的行前列腺穿刺活檢的81例住院患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①直腸指診觸及硬結(jié)節(jié)，懷疑腫瘤；②B超發(fā)現(xiàn)前列腺低回聲結(jié)節(jié)或MRI發(fā)現(xiàn)異常，懷疑腫瘤；③血清PSA＞10.0 ng/ml；④PSA為4.0～10.0 ng/ml，血清總PSA與游離PSA比值（f/tPSA）異?；蚯傲邢偬禺愋钥乖芏龋╬rostate specific antigen density，PSAD）值異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①PSA值正常，直腸指診無(wú)異常，B超及磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）均未發(fā)現(xiàn)異常；②因發(fā)熱、高血壓危象、心臟病心功能失代償、嚴(yán)重出血傾向疾病、糖尿病患者血糖不穩(wěn)定等不適宜穿刺活檢的患者；③既往有前列腺穿刺活檢史、前列腺手術(shù)史及口服5α-還原酶抑制藥的患者；④尿路感染、既往3個(gè)月內(nèi)的急性前列腺炎的患者。研究對(duì)象年齡49～81歲，平均年齡（69.86±7.61）歲；血清PSA表達(dá)水平4.0～108.0 ng/ml，平均表達(dá)水平（21.89±18.40）ng/ml。本研究經(jīng)昆山市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑

雞尾酒抗體試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，RNA溶液保護(hù)劑、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，一次性活檢針購(gòu)自美國(guó)Bard Peripheral Vascular公司，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（realtime reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 尿液標(biāo)本采集 采集標(biāo)本前，告知患者即將進(jìn)行的操作及可能存在的疼痛，緩解患者的緊張情緒。經(jīng)直腸行前列腺按摩，收集前列腺按摩后初始尿液50 ml，1500 r/min，相對(duì)離心力400 g，離心5 min。離心后收集尿沉渣，并加入RNA溶液保護(hù)劑，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 組織采集及前列腺穿刺活檢 采用一次性活檢針在B超引導(dǎo)下經(jīng)會(huì)陰前列腺穿刺活檢，每例患者均取12塊組織（左右兩側(cè)的外周帶內(nèi)、中、外部，移行區(qū)內(nèi)、外部及尖部），浸泡于福爾馬林溶液中，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色及免疫組化雞尾酒染色，確定組織類型并進(jìn)行病理活檢。病理活檢診斷為前列腺癌的患者，行腹腔鏡下經(jīng)腹膜外前列腺癌根治術(shù)，并取適量腫瘤組織加入RNA溶液保護(hù)劑，用于提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 染色方法 ①HE染色：將采集的組織包埋后制成蠟塊，切片、脫蠟、水化，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察染色情況。若12塊組織切片均未觀察到腫瘤組織，診斷為穿刺活檢陰性，即非前列腺癌；反之，診斷為前列腺癌。②將采集的組織切片、脫蠟、水化后，修復(fù)抗原，封閉，采用P63、高分子量角蛋白抗體（high weight molecular cytokeratin，34βE12）及α-甲?；o酶A消旋酶（α-methylacy-coAracemase，P504S）聯(lián)合抗體免疫組化雞尾酒染色，復(fù)染脫水封片。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，正常組織內(nèi)細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)PCA3表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明提取組織或尿沉渣的RNA，滴加RTPCR，合成互補(bǔ) DNA（complementary DNA，cDNA），根據(jù)qPCR試劑盒配制qPCR反應(yīng)體系，并滴加相應(yīng)引物，循環(huán)40次，獲得相應(yīng)閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct），以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)尿PCA3mRNA＜3.97前列腺癌患者的平均表達(dá)水平計(jì)算出對(duì)應(yīng)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值，作為各基因信使 RNA（messenger RNA，mRNA）表達(dá)水平。（表1）

1.4 觀察指標(biāo)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

比較前列腺癌患者與非前列腺癌患者血清PSA和尿PCA3mRNA的表達(dá)水平，分析二者的相關(guān)性。根據(jù)前列腺癌患者尿PCA3mRNA表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者Gleason評(píng)分[6]，總分10分，根據(jù)Gleason評(píng)分評(píng)估前列腺癌組織的分化程度，分化良好2～4分，中度分化5～7分，低度分化8～10分。分析尿PCA3mRNA高表達(dá)和低表達(dá)組患者前列腺癌組織內(nèi)NME1、NME2、NME3、NME4、SPOCK1、SPARC、SPARCL1、livin和survivinmRNA的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0和Graphpad 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；尿PCA3和血清PSA表達(dá)水平間的相關(guān)性采用線性回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qPCR反應(yīng)體系引物序列

2 結(jié)果

2.1 尿PCA3與血清PSA表達(dá)情況及相關(guān)性分析

前列腺穿刺活檢診斷前列腺癌陽(yáng)性53例，陰性28例。53例前列腺癌患者尿PCA3mRNA表達(dá)水平為（3.97±1.71），明顯高于28例非前列腺癌患者的（2.12±1.38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.934，P＜0.01）；前列腺癌患者血清PSA表達(dá)水平為（27.70±18.40）ng/ml，明顯高于非前列腺癌患者的（10.89±5.98）ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.693，P＜0.01）（圖1）。線性回歸分析結(jié)果顯示，前列腺癌患者尿PCA3與血清PSA表達(dá)水平無(wú)線性關(guān)系（P＞0.05）（圖2）。

2.2 尿PCA3 mRNA表達(dá)水平與前列腺癌組織分化程度的關(guān)系

圖1 前列腺穿刺病理活檢結(jié)果（×100）

圖2 前列腺癌患者尿PCA3和血清PSA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

將前列腺癌患者尿PCA3mRNA表達(dá)平均水平3.97作為分界值，≥3.97為表達(dá)水平高，＜3.97為表達(dá)水平低，分別作為高表達(dá)組（n=29）和低表達(dá)組（n=24）。尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者Gleason評(píng)分為（6.38±1.78）分，明顯高于低表達(dá)組患者（4.58±1.69）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.749，P＜0.01）。根據(jù)Gleason評(píng)分，53例前列腺癌患者分化良好16例，中度分化23例，低度分化14例。尿PCA3表達(dá)高水平傾向低、中度分化（χ2=11.162，P=0.004）。（表 2）

表2 尿PCA3 mRNA高表達(dá)和低表達(dá)患者的前列腺癌分化程度

2.3 兩組患者尿PCA3相關(guān)基因表達(dá)水平比較

尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者NME1、NME3和SPARCL1mRNA表達(dá)水平均明顯低于低表達(dá)組患者（P＜0.01）；SPOCK1和survivinmRNA表達(dá)水平均明顯高于低表達(dá)組患者（P＜0.01）。尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者NME2、SPARC、livin和NME4mRNA表達(dá)水平與低表達(dá)組患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 兩組患者尿PCA3及相關(guān)基因表達(dá)情況比較（±s）

表3 兩組患者尿PCA3及相關(guān)基因表達(dá)情況比較（±s）

基因NME1 NME2 NME3 NME4 SPARCL1 SPOCK1 SPARC Survivin Livin高表達(dá)組（n=29）0.56±0.24 1.22±0.36 0.42±0.26 1.12±0.31 0.35±0.22 7.79±2.32 1.45±0.39 8.43±2.32 2.62±1.94低表達(dá)組（n=24）1.43±0.32 1.03±0.41 1.26±0.48 1.21±0.40 1.50±1.82 1.86±0.68 1.54±0.43 1.63±0.48 1.79±1.19 t值11.37 1.80 8.09 0.92 3.38 12.09 0.80 14.10 1.83 P值0.000 0.082 0.000 0.361 0.001 0.000 0.428 0.000 0.073

3 討論

前列腺癌具有潛伏時(shí)間長(zhǎng)、隱匿性高、與年齡呈正相關(guān)等特點(diǎn)，早期容易漏診，如何提高前列腺癌的檢出率已成為臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[7]。PSA是目前前列腺癌常用的篩查指標(biāo)，但前列腺炎、前列腺增生等也可導(dǎo)致PSA升高，故采用PSA篩查前列腺癌假陽(yáng)性率高[8]。PCA3亦稱DD3，最初于1999年由Bussemakers等[9]發(fā)現(xiàn)的，位于常染色體9q21-22，并在前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的非編碼mRNA，相關(guān)研究顯示，PCA3可調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的存活和凋亡，與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，PCA3已成為很有前景的前列腺癌標(biāo)志物[10-11]。

本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)尿PCA3mRNA的表達(dá)水平及相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，前列腺癌患者尿PCA3mRNA及血清PSA表達(dá)水平明顯高于非前列腺癌患者，但二者之間無(wú)明顯線性相關(guān)關(guān)系。前列腺癌患者尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者Gleason評(píng)分明顯高于低表達(dá)組，表明尿PCA3mRNA表達(dá)與前列腺癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)，與Aubin等[12]研究結(jié)果一致。此外，尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者NME1、NME3和SPARCL1 mRNA表達(dá)水平均明顯低于低表達(dá)組患者。NME1、NME3是NM23的家族成員，NM23屬于抑癌基因，與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等相關(guān)[13]；SPARCL1是SPARCL抑癌基因家族成員，與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)[14]。尿PCA3mRNA高表達(dá)組患者SPOCK1和survivinmRNA表達(dá)水平均明顯高于低表達(dá)組患者。前列腺癌組織中SPOCK1的表達(dá)水平升高，可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]；survivin是一種凋亡抑制基因，可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，目前僅在腫瘤及胚胎中表達(dá)[16]。

本研究分析尿PCA3mRNA表達(dá)水平在前列腺癌篩查和進(jìn)展中的作用，但本研究存在樣本量小、研究方向局限等不足。雖然關(guān)于PSA的研究比較廣泛，但其特異度較差，需患者進(jìn)行不必要的穿刺活檢[17]。尿PCA3作為新型腫瘤標(biāo)志物，特異度較高，但關(guān)于其截?cái)帱c(diǎn)的爭(zhēng)議較大，提高ROC曲線截?cái)帱c(diǎn)，雖可提高特異度，但靈敏度隨之降低，反之，特異度相應(yīng)降低[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，尿PCA3mRNA和血清PSA表達(dá)水平間無(wú)線性相關(guān)關(guān)系，故未進(jìn)一步結(jié)合評(píng)價(jià)其對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值。

綜上所述，前列腺癌患者尿PCA3mRNA及血清PSA表達(dá)水平明顯升高，但二者間無(wú)線性關(guān)系。前列腺癌患者尿PCA3mRNA高表達(dá)時(shí)，NME1、NME3、SPARCL1mRNA 表達(dá)水平降低，SPOCK1及survivinmRNA表達(dá)水平升高，SPARC、livin及NME4mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。