王迪，曲媛，劉慧穎，張岳，車軼群#

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院1檢驗科，2放射治療科，北京100021

3北京市朝陽區(qū)三環(huán)腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京 100122

頭頸部腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界惡性腫瘤的第6位，其中鱗狀細胞癌占90%～95%[1]。目前，早期頭頸部鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的治療主要以手術和單純放療或同步放化療為主，5年生存率為40%～60%，但出現(xiàn)遠處轉移和局部復發(fā)的患者，放化療后平均生存時間僅為6～9個月[2]。因此，尋找能夠預測HNSCC遠處轉移和局部復發(fā)的分子標志物是臨床亟待解決的問題。程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）和程序性死亡受體配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也稱 PD-L2）為其配體。近年來應用免疫組織化學方法，已先后在乳腺癌[3]、黑色素瘤[4]、腎細胞癌[5]、肺鱗狀細胞癌[6]、鼻咽癌[7]等人類腫瘤組織中檢測到PD-1和PD-L1的表達。近年來，研究發(fā)現(xiàn)慢性感染環(huán)境使被感染組織發(fā)生癌變的危險程度增加，炎癥成分也存在于與腫瘤相關的微環(huán)境中[8]。血清C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是一種非特異性的急性時相反應蛋白，在機體發(fā)生損傷、炎性反應、感染、腫瘤等情況時會升高。文獻報道，CRP與惡性腫瘤的病理分期、淋巴結轉移、預后等具有相關性[9-12]。本研究收集了69例HNSCC患者的病歷資料，并收集相應的腫瘤組織和外周血標本，旨在研究PD-L1在HNSCC中的表達情況及與外周血CRP水平的關系，并討論PD-L1表達與HNSCC患者1年內發(fā)生遠處轉移的關系，為HNSCC患者的預后評價提供新的方向，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年1月于中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院經病理確診的69例HNSCC患者的腫瘤組織和外周血標本。納入標準：①接受放射治療；②具備完整的臨床資料；③無心臟、肝臟、腎臟、消化道和代謝異常；④無神經系統(tǒng)疾病史。69例患者中，男62例，年齡為27～78歲，中位年齡為55.5歲；女7例，年齡為23～70歲，中位年齡為67.0歲。腫瘤部位：口腔13例，口咽23例，喉14例，下咽19例。

1.2 試劑

兔單克隆抗體PD-L1（1∶200稀釋）、小鼠單克隆抗體P16（即用型）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（1∶200 稀釋）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）（1∶200 稀釋）均購自英國 Abcam公司；免疫組織化學染色試劑盒（PV-9000）、蘇木素均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CRP檢測試劑盒購自北京九強生物技術有限公司；Cobas-8000全自動化分析儀購自羅氏公司。

1.3 免疫組織化學染色和外周血CRP檢測

所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。脫蠟，水合，抗原修復。分別加入PD-L1、P16、EGFR、VEGF抗體，4℃過夜。使用免疫組織化學染色試劑盒進行二抗孵育和染色。操作步驟嚴格按照產品說明書進行。由兩位病理醫(yī)師評估染色強度。＞10%的腫瘤細胞細胞膜和細胞質出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒界定為PD-L1陽性。外周血CRP水平檢測：空腹狀態(tài)下，抽取患者肘靜脈血4 ml，離心分離血清，使用CRP檢測試劑盒，采用免疫透射比濁法測定CRP水平。

1.4 隨訪

治療結束后，每3個月對患者進行1次隨訪，包括胸腹部計算機斷層成像（computed tomography，CT）、頭頸部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。當發(fā)現(xiàn)頭頸部腫塊時，穿刺進行細胞學檢查。隨訪時間為1～17個月。遠處無轉移生存期（distant metastasis-free survival，DMFS）定義為從放療開始到患者出現(xiàn)轉移或隨訪截止時間。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗，等級資料的比較采用秩和檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1表達與HNSCC患者臨床特征的關系

由兩位病理學專家經HE染色診斷為HNSCC（圖1A），免疫組織化學染色顯示PD-L1主要表達于腫瘤細胞的細胞膜和細胞質（圖1B）。HNSCC患者的PD-L1陽性表達率為14.5%（10/69）。PDL1陰性表達和PD-L1陽性表達HNSCC患者的性別、年齡、TNM分期、腫瘤原發(fā)灶分期、淋巴結受累數目、P16表達情況、EGFR表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；PD-L1陰性表達和PD-L1陽性表達HNSCC患者的1年內遠處轉移情況、VEGF表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 HNSCC患者腫瘤組織的HE染色和免疫組織化學染色（×100）

2.2 PD-L1表達情況與HNSCC患者遠處無轉移生存情況的關系

隨訪1～17個月，PD-L1陰性表達HNSCC患者的遠處無轉移生存情況明顯優(yōu)于PD-L1陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.851，P=0.003）。（圖2）

2.3 PD-L1表達情況與外周血CRP的關系

PD-L1陰性表達患者的外周血CRP水平為0.17（0.06，0.88）mg/dl，高于PD-L1陽性表達患者的0.06（0.00，0.21）mg/dl，差異有統(tǒng)計學意義（Z=1.998，P=0.046）。

表1 HNSCC患者腫瘤組織中PD-L1表達情況與臨床特征的關系（n=69）

圖2 PD-L1陽性表達（n =10）和PD-L1陰性表達（n=59）HNSCC患者的遠處無轉移生存曲線

3 討論

PD-1常被稱為免疫調節(jié)中的“檢查點分子”，并協(xié)助維護自我耐受。免疫檢查點分子是指一組免疫受體，當其與配體結合時，傳遞抑制信號以抑制效應功能[13]。腫瘤微環(huán)境由非腫瘤基質細胞構成，包括免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞和新生毛細血管系統(tǒng)等，其通過與腫瘤細胞之間的相互作用來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤發(fā)生、浸潤、進展過程中，腫瘤微環(huán)境會誘導浸潤的T細胞高表達PD-1分子，腫瘤細胞通過高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2，傳遞負性調控信號，導致腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1信號通路持續(xù)激活，T細胞的功能被抑制，無法殺傷腫瘤細胞，最終促進腫瘤進展[14]。PD-1抗體可以通過PD-1/PD-L1信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細胞的活化，下調腫瘤抗原特異性T細胞介導的腫瘤免疫應答，部分恢復T細胞的功能，使這些細胞能夠繼續(xù)殺傷腫瘤細胞，影響腫瘤進展[15]。目前有關HNSCC的臨床試驗結果表明，PD-1/PD-L1抑制劑有較好的抗腫瘤作用，尤其是對復發(fā)轉移的HNSCC患者有效，其中57%的患者出現(xiàn)了腫瘤退縮，客觀緩解率達24.8%[16]。因此，以PD-L1為靶點的免疫調節(jié)對HNSCC是一種新的抗腫瘤策略。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在HNSCC患者中，PD-L1高表達與不良預后有關且不依賴于腫瘤起源，通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達是預后不良的指征，多因素分析驗證了PD-L1可以作為預后生物標志物，獨立于其他眾所周知的預后因素，如腫瘤分期和腫瘤分級[17]。原發(fā)性腫瘤遠處轉移和PD-L1高表達之間有顯著關聯(lián)，提示腫瘤轉移可能與抗腫瘤免疫功能的破壞有關[13]。本研究結果顯示，PD-L1陰性表達HNSCC患者的遠處無轉移生存情況明顯優(yōu)于PD-L1陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.851，P=0.003），與Müller等[17]的研究結果一致。但本研究中，69例HNSCC患者中只有10例（14.5%）患者的PD-L1呈陽性表達，低于Müller等[17]的研究結果（28%的腫瘤組織中PD-L1呈強陽性表達），分析可能是由于免疫組織化學染色中使用的抗體不同或PD-L1陽性的界定標準不一致造成。本研究結果顯示，PD-L1陰性表達HNSCC患者的1年內遠處轉移率為6.8%（4/59），低于PD-L1陽性表達患者的40.0%（4/10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明PD-L1陽性表達HNSCC患者在1年內發(fā)生遠處轉移的風險更高；PD-L1陽性表達患者的VEGF陽性表達率為50.0%，明顯高于PD-L1陰性表達患者的6.8%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示應用抗PD-L1聯(lián)合抗血管生成藥物治療HNSCC具有潛在價值。

目前，檢測PD-L1的方法主要為免疫組織化學法。當有些患者的病變部位經手術切除后無法獲取組織進行PD-L1檢測時，需要找出其他與預后相關且與PD-L1相關的指標來指導評價預后。在腫瘤微環(huán)境中，炎癥有助于惡性腫瘤細胞的增殖和存活、血管生成、腫瘤轉移、適應性免疫的破壞、對激素和化學治療劑的反應降低[8]。CRP是一種典型的急性時相反應蛋白，CRP的合成與致炎性細胞因子有著密切的關系。研究顯示，CRP是白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的替代標志物[18]。本研究通過檢測69例HNSCC患者治療前的外周血CRP水平，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達與外周血CRP水平有關，PD-L1陽性表達患者的外周血CRP水平低于PD-L1陰性表達患者（P＜0.05）。推測可能是由于PD-L1陽性表達的HNSCC患者中PD-1/PD-L1信號通路持續(xù)激活，機體處于免疫抑制狀態(tài)。雖然CRP是一種非特異性炎性標志物，但檢測方法簡單，費用低廉，可作為常規(guī)檢查項目在臨床開展，對HNSCC患者的PD-L1表達水平及機體免疫狀態(tài)具有輔助診斷價值。

綜上所述，PD-L1在HNSCC患者腫瘤組織中的陽性表達率較高，可用于預測HNSCC患者1年內發(fā)生遠處轉移的可能性，同時與外周血CRP水平密切相關，可反映機體的免疫狀態(tài)。PD-L1可能作為HNSCC患者遠處轉移的標志物，可作為靶點進行免疫治療。由于本研究樣本量較少，結果可能存在偏倚，需要擴大樣本量進一步驗證。為了更好地延長HNSCC患者的生存時間，選擇有效的免疫分子標志物和免疫治療方案將為進展期HNSCC的治療開辟新的思路。