劉文鳳 朱佩文 邵毅

角膜是眼球前部的一種圓頂狀的透明結(jié)構(gòu)，是光學系統(tǒng)的重要組成部分，80%的折射率由它產(chǎn)生。正常角膜的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次包括：上皮層、Bowman層、基質(zhì)層、Descemet膜、內(nèi)皮層[1]。角膜是透明無血管的，從淚膜、房水和角膜邊緣的血管中獲取營養(yǎng)[2]。獲取的營養(yǎng)物質(zhì)在角膜細胞線粒體內(nèi)經(jīng)氧化分解產(chǎn)生能量，以維持各種功能。自從Leber視神經(jīng)遺傳病被發(fā)現(xiàn)后，越來越多的研究表明線粒體功能障礙與眼部疾病，尤其是角膜疾病密切相關(guān)。

1 線粒體結(jié)構(gòu)和功能

線粒體是真核細胞內(nèi)由兩層膜包被的細胞器，直徑為0.5～1.0 μm，機體不同部位細胞所含線粒體數(shù)目差別很大。線粒體外膜光滑，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴，中央部分為基質(zhì)。基

質(zhì)中的線粒體基因組是一個與核DNA分離的封閉環(huán)狀分子，正常人線粒體DNA長16 569 bp，包含37個基因，其中13個基因編碼的酶對于大多數(shù)細胞產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)的氧化磷酸化途徑至關(guān)重要[3]。

線粒體的主要功能是氧化糖類、脂肪和氨基酸，產(chǎn)生能量以供細胞利用。來自淚膜、房水、角膜邊緣的營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)編碼的各種酶的作用下，經(jīng)過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，同時也產(chǎn)生熱能。除此之外，線粒體還具有協(xié)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣離子調(diào)控鈣離子水平、調(diào)節(jié)膜電位，并控制細胞程序性死亡、調(diào)節(jié)細胞增殖與細胞代謝、合成膽固醇及某些血紅素等功能。

2 角膜細胞氧化應激和線粒體功能障礙

角膜中主要有3種細胞：角膜上皮細胞、角膜基質(zhì)中的角質(zhì)細胞和高度分化的角膜內(nèi)皮細胞。角膜上皮中央厚度約為50 μm，細胞新陳代謝高度活躍，每5～7 d更新1次。基質(zhì)是由緊密排列的平行膠原纖維和角質(zhì)細胞組成的一種有序排列的膠原質(zhì)組織，約占角膜的90%[4]。內(nèi)皮細胞為六邊形細胞，核大，胞內(nèi)含豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，在保持角膜水合狀態(tài)和透明度方面起關(guān)鍵作用。

角膜高度暴露于自然界，接收大量高張力的大氣氧和陽光，包括紫外線(ultraviolet，UV)，導致角膜內(nèi)反應性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成和細胞氧化損傷。由于mtDNA修復機制效率低、轉(zhuǎn)錄率高、缺乏組蛋白的保護以及位置鄰近生成大量ROS的線粒體內(nèi)膜，mtDNA尤其容易受到氧化損傷而突變。ROS是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)物，它隨后會導致線粒體進一步損傷，逐漸受損的線粒體會變得不那么有效，失去其功能完整性，釋放更多的ROS，從而加劇氧化損傷[5]。角膜ROS的過度積累影響信號轉(zhuǎn)導和細胞增殖，促進細胞死亡。隨著年齡的增長，功能紊亂的線粒體逐漸積累，而線粒體功能障礙又進一步導致mtDNA突變，形成一種“惡性循環(huán)”，最終導致細胞活力喪失和細胞凋亡。UV還誘導過氧化氫分解，在角膜和皮膚中產(chǎn)生羥基自由基，這可能對DNA和脂質(zhì)等大分子造成損傷，進一步加重線粒體功能障礙。

當然，角膜也配備了一個抗氧化防御系統(tǒng)來抵消自由基等氧化應激的作用，這一系統(tǒng)包括低分子量抗氧化劑(維生素C、維生素E、胡蘿卜素、還原型谷胱甘肽和鐵蛋白等)和高分子量抗氧化劑[過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶等][6]。由于外界環(huán)境壓力的影響，抗氧化劑被逐漸消耗。并且隨著年齡增大，角膜抗氧化酶(SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶)的活性大大降低，而ROS生成的酶——黃嘌呤氧化酶活性僅略微下降，所以年齡也是角膜氧化防御失衡的原因之一。

3 線粒體功能障礙與角膜疾病

3.1遺傳性線粒體疾病線粒體疾病是指由細胞核DNA或mtDNA突變導致的以線粒體功能障礙為特征的一系列臨床疾病，通常具有遺傳性，如Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)和Pearson綜合征[7-8]。KSS是一種罕見的神經(jīng)肌肉疾病，由mtDNA大片段缺失引起，缺失范圍為1000～10 000 bp，最常見的是缺失12個基因共4979個堿基對，也可在少數(shù)患者中檢測到A3243G點突變[9-10]。KSS臨床表現(xiàn)為上瞼下垂、眼外肌的漸進性癱瘓、進行性視網(wǎng)膜功能障礙和角膜內(nèi)皮功能障礙。KSS患者角膜上皮和基質(zhì)水腫導致視力下降、不適和疼痛。透射電鏡顯示，KSS患者角膜上皮細胞外觀為空泡狀，并伴有扭曲嵴的異常線粒體。角膜內(nèi)皮無氧糖酵解增加乳酸積累，高濃度的乳酸具有促凋亡效應，可能加重角膜內(nèi)皮功能障礙。因此，角膜內(nèi)皮功能障礙是KSS的一個重要特征。

角膜內(nèi)皮功能障礙也被認為是Pearson綜合征的眼部表型之一。Pearson綜合征多數(shù)由mtDNA的大量缺失或重排導致紅細胞酶缺陷引起，為常染色體顯性遺傳。在嬰幼兒期Pearson綜合征表現(xiàn)為難治性鐵幼粒細胞貧血癥、全血細胞減少癥、骨髓前體空泡化和胰腺外分泌功能紊亂，眼部表現(xiàn)為雙側(cè)薄霧狀角膜間質(zhì)、角膜增厚、角膜完全性上皮水腫和內(nèi)皮功能障礙。Pearson綜合征患者預期壽命顯著降低，但隨著年齡的增加，患者眼部臨床特征演變?yōu)镵SS[11]。

3.2圓錐角膜圓錐角膜是指角膜中央進行性變薄、擴張，使得角膜向前突出成錐形。該病嚴重程度可從近視、散光到嚴重的角膜圓錐形突出、瘢痕，甚至失明。大多數(shù)患者需要配戴復雜性的隱形眼鏡，20%的患者需要角膜移植，是導致年輕人角膜移植的主要原因。

Kenney等[12]對圓錐角膜的發(fā)生機制提出了以下假說：患者角膜中自由基代謝異常和氧化應激、細胞凋亡、醛類和過氧亞硝酸鹽類潴留等原因使得角膜出現(xiàn)局部的變薄和突出。Pathak等[13]在20例圓錐角膜病例中進行線粒體復合物Ⅰ基因測序，檢測出18例有非同義性突變和移位突變。De等[14]在圓錐角膜患者發(fā)現(xiàn)SOD1基因169+50delTAAACAG，表明SOD1基因也可能參與圓錐角膜發(fā)病機制。而Abuamero等[15]研究26例圓錐角膜患者組織，發(fā)現(xiàn)單獨mtDNA突變一般不造成圓錐角膜，mtDNA突變累積到一定程度才發(fā)病。這些mtDNA突變會導致ROS水平升高，細胞對ROS的易感性也增加，增高的ROS可以通過提高角膜細胞降解酶活性和減少膠原合成等多個過程促進圓錐角膜的發(fā)展。另外，免疫組織化學染色顯示圓錐角膜上皮細胞和基質(zhì)中存在，進一步提供圓錐角膜中DNA氧化損傷的證據(jù)。

氧化應激導致的細胞凋亡尤其是前基質(zhì)細胞的凋亡，可造成角膜基質(zhì)變薄[16]。在電子顯微鏡可觀察到圓錐角膜上皮細胞的細胞質(zhì)囊泡變性和腫脹，同時也可觀察到多種凋亡相關(guān)分子的組織學特征和非典型表達，包括DNA斷裂、細胞收縮、凋亡小體的生成和染色質(zhì)凝聚、碎裂[17]。Galvis等[18]報道反應性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)也參與了圓錐角膜的發(fā)病機制，Bowman層斷裂部位的血管內(nèi)皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)水平升高，NOS將精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮(nitric oxide,NO)，在這些角膜區(qū)域NO的生成增加，高水平過氧亞硝酸鹽、NO和ROS的細胞毒性作用會損害DNA，降低基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)水平，激活基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)。另外圓錐角膜中明膠酶A的活性增加，MMP和明膠酶A均為蛋白酶，能促進細胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白Ⅳ、膠原Ⅴ、纖維蛋白和層蛋白)的消化[19]。Arnal等[20]發(fā)現(xiàn)圓錐角膜含有高水平的活性醛，如丙二醛和4-羥基-2-壬烯醛，它們是由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，并能破壞細胞內(nèi)大分子物質(zhì)。這些醛可引起溶酶體膜的改變，而溶酶體膜破裂也會釋放蛋白水解酶，從而激活細胞凋亡途徑。同時圓錐角膜中的抗氧化水平也可能改變，如抗氧化劑谷胱甘肽水平顯著降低?？傊?，mtDNA突變、DNA氧化損傷、NO和TIMP-1相關(guān)凋亡細胞凋亡增加，蛋白酶和活性醛相關(guān)的溶酶體水解酶的釋放、抗氧化劑水平的降低均可能參與圓錐角膜的發(fā)生和發(fā)展。

3.3Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)是一種的漸進性的雙側(cè)眼部疾病，特征是角膜內(nèi)皮細胞逐漸減少，角膜的水化能力降低，角膜透明性逐漸下降和視力下降。FECD發(fā)病率為4%，患者年齡多為30～50歲。FECD的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認為是遺傳和環(huán)境因素共同作用所致[21]。角膜內(nèi)皮細胞由于暴露于光照和其本身高代謝活動，及缺乏自然再生能力，容易受到線粒體功能障礙和氧化損傷的影響。FECD患者的角膜組織ROS水平升高，氧化損傷程度的標志物8-OHDG也較高。Wojcik等[22]報道與對照組相比，F(xiàn)ECD患者DNA損傷水平更高，DNA修復的有效性明顯低于對照組。DNA損傷(包括鏈斷裂、基底修飾和無堿基位點的氧化損傷)阻礙DNA聚合酶的作用，所以只有未受損的DNA模板才能參與聚合酶鏈反應。因此，DNA擴增與DNA損傷成反比，即病灶越多，擴增幅度就越小[23]。而FECD患者大多數(shù)DNA損傷位于mtDNA中，表明mtDNA是氧化損傷的主要目標。

FECD患者角膜氧化應激增加將導致內(nèi)皮細胞DNA氧化損傷、內(nèi)皮細胞形態(tài)學改變和細胞凋亡。溫茜等[24]在動物模型中利用UV-B刺激小鼠產(chǎn)生ROS，ROS的光氧化損傷作用誘導角膜內(nèi)皮細胞凋亡。而在FECD內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下調(diào)，Nrf2介導的抗氧化防御反應降低和p53相互作用誘導內(nèi)皮細胞凋亡[25]。Ziaei等[26]報道使用Nrf2的激動劑環(huán)丁砜處理FECD患者角膜結(jié)果顯示，抗氧化分子過度表達和細胞內(nèi)ROS減少，內(nèi)皮細胞凋亡也減少。

在FECD中，角膜抗氧化劑的正常生理也受到影響。FECD角膜細胞蛋白質(zhì)組分析顯示，谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶、乙醛脫氫酶3A1、鐵蛋白、血紅素氧合酶、熱休克蛋白和過氧化物酶均下調(diào)。過氧化物酶和熱休克蛋白可能在FECD中發(fā)揮重要作用，因為它們都參與了細胞凋亡的過程。此外，F(xiàn)ECD患者角膜內(nèi)皮細胞中SOD2和硫氧還蛋白還原酶也降低，而這些抗氧化酶的下調(diào)可干擾組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和FECD中凋亡通路的激活?？傮w來說，F(xiàn)ECD患者角膜細胞中mtDNA突變、細胞凋亡增加和抗氧化劑功能降低導致角膜內(nèi)皮細胞代謝異常，并逐漸發(fā)展為功能障礙。

4 總結(jié)與展望

角膜是眼光學系統(tǒng)的重要組成部分，角膜相關(guān)疾病可能導致視力下降甚至喪失。本綜述總結(jié)了與氧化、抗氧化應激失衡相關(guān)的3種角膜疾病，提供了氧化應激和線粒體功能障礙在遺傳性和后天性角膜病變發(fā)病機制中的作用日益明顯的證據(jù)。角膜的生理結(jié)構(gòu)使其本身易受氧化損傷的影響，氧化和抗氧化劑水平失衡會導致mtDNA突變，突變mtDNA可以隨著時間的推移不斷累積，一旦超過閾值，細胞產(chǎn)生能量障礙，將會出現(xiàn)疾病的臨床表型。

基于上述機制，可以使用抗氧化劑治療某些角膜疾病，如使用抗氧化性物質(zhì)抗壞血酸、維生素E、SOD、輔酶Q10保護線粒體功能，減少角膜損傷。隨著醫(yī)學的快速發(fā)展，人們對線粒體異常在角膜疾病中認識逐漸加深，促進了新的治療藥物的發(fā)展，未來可以靶向線粒體治療某些角膜疾病，預防或減少視力喪失。同時也應關(guān)注線粒體功能障礙是否參與其他角膜疾病甚至角膜外的眼部疾病，從而為疾病治療提供新的方向。此外，mtDNA是母系遺傳，對患者進行突變鑒定、提供遺傳咨詢來預防后代患遺傳性線粒體功能障礙相關(guān)角膜疾病也是很有必要的。