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        放射誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的研究進(jìn)展

        2019-02-27 02:13:53龔玉華徐中葉
        醫(yī)療裝備 2019年1期
        關(guān)鍵詞:效應(yīng)信號(hào)研究

        龔玉華,徐中葉

        江蘇省無(wú)錫市人民醫(yī)院 (江蘇無(wú)錫 214023)

        自倫琴發(fā)現(xiàn)X射線至今,電離輻射已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床疾病的診斷和治療,其中的放射治療發(fā)展尤為迅猛。人們?cè)?jīng)認(rèn)為電離射線穿過(guò)細(xì)胞核引起的直接或間接的DNA損傷是產(chǎn)生放射治療生物學(xué)效應(yīng)的唯一原因[1]。1992年,Nagasawa和Little發(fā)現(xiàn)在單層培養(yǎng)的細(xì)胞中,少于1%的細(xì)胞的細(xì)胞核被單束α射線穿透,出現(xiàn)姐妹染色體交換頻率增加的細(xì)胞卻超過(guò)30%[2]。這一發(fā)現(xiàn)激發(fā)了研究者們對(duì)放射誘導(dǎo)的所謂“旁觀者效應(yīng)”的興趣,一系列與之相關(guān)的研究隨之開(kāi)展。利用高線性能量傳遞(LET)射線如α射線、重粒子,或者低LET射線如X射線、γ射線,針對(duì)不同細(xì)胞分別進(jìn)行的體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了旁觀者效應(yīng)的存在[3-4],并初步探討了其發(fā)生機(jī)制。然而,該效應(yīng)的確切機(jī)制目前尚不清楚。本研究對(duì)近十年內(nèi)提出的放射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)(radio induced bystander effects,RIBE)發(fā)生機(jī)制及其常用研究方法進(jìn)行綜述。

        1 研究方法

        放射誘導(dǎo)的旁觀者效應(yīng)中存在兩類細(xì)胞,即“作用細(xì)胞”(受照射的細(xì)胞)與“反應(yīng)細(xì)胞”(旁觀者細(xì)胞),前者受照射后產(chǎn)生信號(hào)分子通過(guò)細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)傳遞或釋放到細(xì)胞外圍環(huán)境中,后者接收這些信號(hào)并產(chǎn)生與前者相類似的輻射損傷誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng),如誘導(dǎo)基因表達(dá)、基因突變、微核形成、誘導(dǎo)分化、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等[5]。在諸如X射線、γ射線、重粒子等輻射中,目前使用高LET的α射線,特別是以精確的微束形式甚至特定的粒子數(shù)目照射一定的區(qū)域、單個(gè)細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[6-7]的方法最為常見(jiàn)。有研究者將“作用細(xì)胞”與“反應(yīng)細(xì)胞”共同單層培養(yǎng)或三圍聚集培養(yǎng),旨在保證兩者間的物理接觸以便于讓細(xì)胞間的縫隙連接發(fā)揮傳遞信息的作用(gap junctiongmediated intercellular communication,GJIC)。相反,有研究側(cè)重于探討由“作用細(xì)胞”釋放入培養(yǎng)基環(huán)境中的信號(hào),常在同一培養(yǎng)基中以稀疏集落培養(yǎng)上述兩類細(xì)胞,或者收集受照射的“作用細(xì)胞”周圍介質(zhì)來(lái)培養(yǎng)“反應(yīng)細(xì)胞”,即所謂的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(cocuhure/media transfer experiments)[8]。

        2 DNA損傷現(xiàn)象

        旁觀者細(xì)胞的DNA損傷在旁觀者效應(yīng)的發(fā)生中有著重要的作用,與受照射細(xì)胞一樣,其DNA可能發(fā)生的損傷在類型和分布上都相當(dāng)復(fù)雜,目前已被識(shí)別的有20多種,包括堿基突變、DNA單鏈斷裂(SSB)、雙鏈斷裂(DSB)以及共價(jià)結(jié)合所導(dǎo)致的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-DNA交聯(lián)等。在受到直接照射的“作用細(xì)胞”中,因DNA雙鏈斷裂引起的染色體異常占主導(dǎo),而“反應(yīng)細(xì)胞”的染色體異常則多因堿基損傷或是單鏈斷裂所致[9]。研究者們常通過(guò)觀察微核形成(MN)、姐妹染色體交換(SCE)及使用γH2AX foci技術(shù)等作為DNA、染色體損傷的證據(jù)[10]。Kashino等[11-12]利用共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),將接受過(guò)1 Gy常規(guī)X射線照射的3種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)(包括野生型、缺乏SSB修復(fù)能力和缺乏DSB修復(fù)能力)的培養(yǎng)基質(zhì)分別轉(zhuǎn)移給缺乏DSB修復(fù)能力的xrs5細(xì)胞,培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣本中xrs5細(xì)胞發(fā)生MN的程度并無(wú)差異。然而,將受X射線照射過(guò)的CHO細(xì)胞的基質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)基中,在這一培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)具有DNA修復(fù)能力的CHO及不具有DSB修復(fù)能力的xrs5細(xì)胞,利用克隆形成分析兩者,結(jié)果發(fā)現(xiàn)xrs5細(xì)胞對(duì)可能存在的“旁觀者信號(hào)”的敏感程度明顯高于CHO。綜合以上實(shí)驗(yàn),Kashino等[11-12]提出接收旁觀者信號(hào)的細(xì)胞的DNA修復(fù)能力決定了旁觀者細(xì)胞的復(fù)雜應(yīng)答反應(yīng),而非產(chǎn)生這些信號(hào)的細(xì)胞的DNA修復(fù)能力。

        旁觀者細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷影響細(xì)胞的功能與存活,是旁觀者效應(yīng)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。有研究認(rèn)為這與旁觀者細(xì)胞活性氧簇的形成、線粒體功能和線粒體依賴的信號(hào)通路以及鈣離子的流動(dòng)[13]有關(guān),其具體機(jī)制仍然是一個(gè)研究熱點(diǎn)。

        3 涉及機(jī)制

        3.1 活性氧簇、線粒體和核因子-кB

        活性氧簇(ROS)是一類化學(xué)性質(zhì)極活潑的物質(zhì),在正常人體內(nèi)通過(guò)氧代謝產(chǎn)生,對(duì)細(xì)胞、組織具有一定的損傷作用。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)放射線照射后的細(xì)胞ROS增多,另有大量證據(jù)表明ROS與旁觀者效應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān),但是ROS極不穩(wěn)定的特性決定了其作用時(shí)限和范圍的局限性,如羥自由基的存在時(shí)間和彌散能力均是以納秒、納米來(lái)計(jì)的,這些都提示ROS的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。Shao等[15]在照射T98G細(xì)胞引起AG01522細(xì)胞旁觀者效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)ROS的產(chǎn)生還與NO,TGF-β1有關(guān)。Chen等[16]利用共培養(yǎng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),將rho(+)細(xì)胞和 rho(-)細(xì)胞照射10 min后的基質(zhì)分別轉(zhuǎn)移給旁觀者細(xì)胞培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射rho(+)細(xì)胞得到的基質(zhì)引起旁觀者細(xì)胞ROS增加了35%,明顯高于另一組,而通過(guò)觀察γH2AX foci發(fā)現(xiàn)ROS增加明顯的旁觀者細(xì)胞DNA損傷較另一組嚴(yán)重的多,另外,ROS清除劑DMSO處理后的細(xì)胞DNA損傷明顯減輕。該實(shí)驗(yàn)一方面證實(shí)了活性氧簇在旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮著巨大作用,另一方面提示了旁觀者細(xì)胞ROS的量以及DNA損傷程度與受照射細(xì)胞的線粒體DNA功能存在一定的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)缺乏線粒體DNA的人皮膚纖維母細(xì)胞無(wú)論作為受照射細(xì)胞還是旁觀者細(xì)胞,其所得到的旁觀者效應(yīng)強(qiáng)度均不如野生型,這一點(diǎn)更加證實(shí)了線粒體功能的重要性。利用Bay11抑制核因子-кB活性、PTIO清除NO或通過(guò)抑制鈣離子的攝取從而抑制iNOS都能增強(qiáng)旁觀者細(xì)胞的DNA穩(wěn)定性,減少突變發(fā)生的頻率[17-18]。

        根據(jù)以上分析,一條依賴于線粒體功能,有活性氧簇參與,以iNOS、NO、核因子-кB為主線的旁觀者效應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制呈現(xiàn)在眼前,這為進(jìn)一步探究更精確的機(jī)制提供了思路。

        3.2 可溶性因子擴(kuò)散與MAPK通路

        研究表明,受照射后的細(xì)胞可能釋放一些可溶性因子,這些因子一方面形成了細(xì)胞周圍的炎癥微環(huán)境,另一方面可能與未照射的臨近細(xì)胞接觸,引發(fā)旁觀者效應(yīng),這可能是RIBE發(fā)生的重要機(jī)制之一。已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)存在的可溶性因子包括TGF-β1[14]、白介素-6、白介素-8[19]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。有證據(jù)顯示白介素-8、TGF-α、TNF-α和TGF-β1可以與旁觀者細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合,激活旁觀者細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路家族[9]。MAPK信號(hào)通路家族包括ERK、JNK和p38,以上的分泌因子激活這些通路,并進(jìn)一步通過(guò)核因子-кB、AP1和ATF-2等影響旁觀者細(xì)胞的生存能力和基因突變,從而表現(xiàn)出旁觀者效應(yīng)。Coates等[20]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)在受照射后炎癥微環(huán)境的形成和引發(fā)基因型依賴的旁觀者效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。針對(duì)可溶性因子及受體和MAPK通路的深入研究或許將使掌控旁觀者效應(yīng)成為可能。

        3.3 GJIC的作用

        縫隙連接(GJ)又稱融合膜,散在分布于相鄰細(xì)胞間,是動(dòng)物細(xì)胞中最普遍存在的一種細(xì)胞連接。它由6個(gè)柱狀蛋白質(zhì)亞基組成,這些亞基環(huán)形排列形成通道樣結(jié)構(gòu)連接相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜。這種通道結(jié)構(gòu)可以允許分子量低于1500的水溶性分子直接通過(guò),通道在pH值降低或鈣離子濃度升高時(shí)會(huì)變小甚至關(guān)閉,以保護(hù)臨近細(xì)胞不受影響[21]。目前大量證據(jù)表明GJIC參與了旁觀者效應(yīng)的發(fā)生[2,9]。為研究縫隙連接對(duì)于旁觀者效應(yīng)的作用,大部分實(shí)驗(yàn)都選用以α射線照射單層培養(yǎng)的細(xì)胞中的一小部分,通過(guò)觀察非照射部分的應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)行判斷。Shao等[22]嘗試使用重粒子(碳粒子束)照射單層培養(yǎng)的人纖維母細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)照射劑量越低,發(fā)生微核形成的數(shù)目卻在增加,并且這種對(duì)低劑量照射的敏感性隨著GJIC增強(qiáng)劑8-Br-cAMP的使用而增強(qiáng),相反,GJIC的抑制劑林丹則可明顯減弱基因的毒性反應(yīng)。然而,允許通過(guò)縫隙連接的分子種類繁多,可以是核苷酸、多肽或者第二信使等,具體是何種分子的傳遞引發(fā)了旁觀者效應(yīng)有待進(jìn)一步的研究揭示。

        4 總結(jié)與展望

        經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究,人們對(duì)旁觀者效應(yīng)的認(rèn)識(shí)正在日漸加深。根據(jù)旁觀者效應(yīng)已知的一些特點(diǎn)可以推測(cè),它對(duì)腫瘤的放射治療有著重大的建設(shè)性作用:利用它對(duì)未照射細(xì)胞的影響,可以減少照射劑量,縮小照射范圍而達(dá)到相同的治療效果;阻斷它對(duì)鄰近正常組織的效應(yīng)則可以起到保護(hù)正常組織、提升放射治療靶向特異性的作用。相信隨著研究的繼續(xù)深入,對(duì)放射誘導(dǎo)旁觀者效應(yīng)的機(jī)制認(rèn)識(shí)將更加透徹,并最終可以將其應(yīng)用到放射治療和防護(hù)的實(shí)際工作中。

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