張宇標(biāo)，李皓桓

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨外科，武漢 430060)

關(guān)節(jié)軟骨覆蓋在大部分活動(dòng)關(guān)節(jié)的滑膜面，是骨骼的重要結(jié)構(gòu)之一，其表面光滑、富有彈性接近無摩擦，保證了關(guān)節(jié)的光滑[1]。關(guān)節(jié)軟骨不僅能在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)減少關(guān)節(jié)之間的摩擦力，同時(shí)也能分散承重壓力，保護(hù)軟骨下骨組織[2]。關(guān)節(jié)軟骨無神經(jīng)和血管，營養(yǎng)主要由滑液和關(guān)節(jié)囊滑膜層周圍的動(dòng)脈分支供應(yīng)。一旦出現(xiàn)損傷，自身無法修復(fù)[3]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一存在的細(xì)胞，占關(guān)節(jié)軟骨體積的2%～10%，其余為軟骨外基質(zhì)(主要成分為Ⅱ型膠原和蛋白聚糖)。在膠原纖維之間，散在分布著軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細(xì)胞組成，軟骨細(xì)胞通過酶降解和基質(zhì)分泌來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的穩(wěn)態(tài)，這些軟骨細(xì)胞的能量代謝維持關(guān)節(jié)軟骨的正常組織代謝，一旦軟骨細(xì)胞的能量代謝平衡被打破，將嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)軟骨的正常功能[4]。目前研究者對(duì)軟骨細(xì)胞的能量代謝方面研究尚不深入，現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞能量代謝的瓦氏效應(yīng)和Crabtree效應(yīng)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 關(guān)節(jié)軟骨的構(gòu)成及生理特點(diǎn)

1.1軟骨組織的構(gòu)成及其各層次的生理特點(diǎn) 軟骨是由水(60%～85%)、ECM和軟骨細(xì)胞組成的無血管和神經(jīng)組織[4-5]。ECM主要由膠原蛋白和蛋白聚糖聚集體組成[1]，其中Ⅱ型膠原占ECM中膠原蛋白的90%～95%，并形成與蛋白多糖聚集體交織的纖維。ECM中的第二大類分子是蛋白聚糖，蛋白聚糖與透明質(zhì)酸相互作用形成蛋白聚糖聚集體。這種復(fù)合物維持了軟骨可壓縮、可拉伸和耐摩擦的特性，使其能夠在狹窄的關(guān)節(jié)環(huán)境中生存和發(fā)揮自身作用[6-7]。其他ECM成分包括軟骨寡聚蛋白、軟骨連接蛋白、透明質(zhì)酸等。宏觀上，關(guān)節(jié)軟骨是多層次的異向性和異質(zhì)性組織，可以分成表層區(qū)、中層區(qū)、深層區(qū)3部分。每個(gè)區(qū)域之間ECM結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞表型和細(xì)胞形狀不同，同時(shí)作用也不同[8]。表層區(qū)的Ⅱ型膠原纖維與關(guān)節(jié)表面平行排列，可以抵抗由關(guān)節(jié)連接產(chǎn)生的關(guān)節(jié)面的剪切力。在軟骨表面區(qū)域，軟骨細(xì)胞尚未發(fā)育完全，體型小呈扁橢圓形，細(xì)胞長軸與軟骨表面平行，多為單個(gè)存在，細(xì)胞密度最大[9]。在軟骨的中央，軟骨細(xì)胞成群分布，每群2～8個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞均由一個(gè)軟骨細(xì)胞分裂而來，故稱同源細(xì)胞群，電鏡下，軟骨細(xì)胞表面有許多小突起，胞質(zhì)內(nèi)有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體以及少量糖原和脂滴。40%～60%的中層區(qū)軟骨含有隨機(jī)排列的Ⅱ型膠原纖維和圓形軟骨細(xì)胞；在關(guān)節(jié)軟骨深層區(qū)，膠原纖維垂直于關(guān)節(jié)面排列。蛋白多糖含量從淺層到深層增加，而水化作用則由淺層到深層減少。

1.2軟骨細(xì)胞特點(diǎn)及其同能量代謝的相關(guān)匹配因素 關(guān)節(jié)軟骨中與ECM相比，軟骨細(xì)胞數(shù)量少、體積小，增殖和代謝能力低[10]。軟骨中含有高濃度乳酸和糖酵解代謝的各種酶，含氧低，能量來源于厭氧代謝途徑。軟骨下的骨皮質(zhì)中分布有許多的微動(dòng)脈、微靜脈和神經(jīng)分支,一直延伸到軟骨下的鈣化軟骨層,營養(yǎng)深層軟骨。但維持軟骨細(xì)胞正常生理活動(dòng)的營養(yǎng)物質(zhì)絕大部分是通過關(guān)節(jié)液滲透，經(jīng)基質(zhì)彌散來營養(yǎng)軟骨細(xì)胞[11]。各種營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過軟骨基質(zhì)的彌散系數(shù)只有水的一半，這種彌散是一種被動(dòng)過程，即在滑液流動(dòng)時(shí)，軟骨能得到充分營養(yǎng)，而在關(guān)節(jié)制動(dòng)時(shí)滑液停滯，分子彌散阻力增加，深部軟骨細(xì)胞營養(yǎng)獲得減少。所以在關(guān)節(jié)反復(fù)負(fù)載的情況下，才能保持正常軟骨的代謝。同時(shí)，軟骨下骨組織所分泌的營養(yǎng)物質(zhì)，也能經(jīng)彌散透過鈣化軟骨區(qū)向深層區(qū)的細(xì)胞提供能量[12]。軟骨組織中氧含量極低[11,13-14]，表層區(qū)稍高，為5%～10%，深層區(qū)可低至1%，而動(dòng)脈血中的氧含量高達(dá)13%[15]，所以軟骨細(xì)胞內(nèi)化和血管形成的固有缺陷阻止成人的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行任何實(shí)質(zhì)性的自我修復(fù)[8]。因此，有別于血供豐富的其他細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境和能量代謝獨(dú)具特點(diǎn)。

軟骨無血管，滑液中氧含量相對(duì)較低和關(guān)節(jié)軟骨厚度較高，環(huán)境氧氣張力較低[10]。相比血氧供應(yīng)充足的細(xì)胞(比如肝細(xì)胞)，軟骨細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量少[16]，而該特點(diǎn)恰能與關(guān)節(jié)部位的低氧、缺血內(nèi)環(huán)境相適應(yīng)。有報(bào)道軟骨細(xì)胞生長最佳氧含量為5%[13]，在這一條件下，軟骨細(xì)胞ATP合成量顯著提高，其中絕大部分ATP通過糖酵解途徑中的底物水平磷酸化合成[17-18]。

2 軟骨細(xì)胞瓦氏效應(yīng)

德國生理學(xué)家奧托·海因里?！ね郀柋ぜ捌渫掠?0世紀(jì)20年代在腫瘤細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在增殖過程中隨著乳酸產(chǎn)量的增加而呼吸減少，即細(xì)胞增殖速度越快，乳酸生產(chǎn)速率越高，這表明癌細(xì)胞主要依靠發(fā)酵代謝來產(chǎn)生ATP[19]。即使在氧氣較為充足的情況下，癌細(xì)胞也傾向于通過糖酵解而不是氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[20]。這種代謝現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或瓦氏效應(yīng)[21]。軟骨細(xì)胞的代謝在低氧條件下以糖酵解為主，但即使在高氧環(huán)境中(如21%氧含量，相對(duì)于軟骨細(xì)胞為高氧)，這種代謝模式仍能維持。研究者通過對(duì)比關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在21%氧含量和低于1%氧含量下對(duì)外源性葡萄糖的攝入量及乳酸產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在21%氧含量下，絕大部分外源性葡萄糖仍然轉(zhuǎn)化成為乳酸，而非進(jìn)入氧化磷酸化途徑，即所謂的“負(fù)巴斯德效應(yīng)”[22]。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)(即21%氧含量)利用線粒體進(jìn)行氧化呼吸以生成ATP，但這僅占總ATP量的25%左右[22-23]?？梢酝茰y，余下的ATP應(yīng)該通過糖酵解進(jìn)行合成。

缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的表達(dá)是“瓦氏效應(yīng)”發(fā)生的基礎(chǔ)。HIF-1在低氧條件下穩(wěn)定表達(dá)，能調(diào)控葡萄糖攝入、糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)，維持低氧下細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1是促使細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要蛋白，是一種由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基共同組成異源二聚體。β亞基在細(xì)胞核內(nèi)恒定表達(dá)，而α亞基存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，只在低氧下表達(dá)[24]。HIF-1α參與缺氧代謝組織(如關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)的低氧反應(yīng)。在生長板中，發(fā)現(xiàn)HIF-1α是軟骨細(xì)胞活力、代謝和基質(zhì)產(chǎn)生所必需的。軟骨細(xì)胞處在無血供的軟骨基質(zhì)中，構(gòu)成了一個(gè)低氧、低糖的環(huán)境，所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧來自關(guān)節(jié)液滲透或彌散。HIF-1是維持低氧環(huán)境下軟骨細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)的重要蛋白[25]。在氧充足時(shí)(如21%氧含量)，HIF-1α發(fā)生羥基化。腫瘤抑制因子與羥基化HIF-1α連接之后被泛素化酶識(shí)別；最終，泛素化的HIF-1α在蛋白酶體和溶酶體的共同作用下發(fā)生降解。正常細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的半衰期很短(<5 min)，表達(dá)量極低，往往較難檢測[24,26]，在低氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的輔氨酸羥化酶2，因缺乏氧這一催化因素，無法羥基化HIF-1α亞基上的兩個(gè)輔氨酸殘基，導(dǎo)致輔氨酸殘基不能與腫瘤抑制因子上的絲氨酸和組氨酸形成氫鍵，HIF-1α也就無法泛素化，進(jìn)而可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[26]。正常氧含量下，HIF-1α被細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白酶標(biāo)記并且泛素化，隨后水解，因此在通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化偶聯(lián)獲取ATP的大部分細(xì)胞中，HIF-1α表達(dá)量極低，難以檢測。但是在某些細(xì)胞中，如軟骨細(xì)胞、髓核細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞，依然能表達(dá)并可檢測到HIF-1α[27]。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)同樣能上調(diào)HIF-1α。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)的一大類蛋白家族，是重要的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)控?cái)?shù)百種基因的表達(dá)。NF-κB家族包括NF-κB和Rel兩個(gè)亞族，其成員分別為p50、p52和RelA、RelB、c-Rel，其共同特點(diǎn)是具有RHD結(jié)構(gòu)域(Rel-homology domain)，此結(jié)構(gòu)域不僅可以使NF-κB家族的不同蛋白互相結(jié)合、形成同源二聚體或者異源二聚體，同時(shí)也是NF-κB家族結(jié)合DNA的位點(diǎn)[28]。Rel亞族的C端具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，能激活基因轉(zhuǎn)錄；NF-κB亞族必須與Rel亞族通過RHD結(jié)合才能獲得轉(zhuǎn)錄基因的功能[28]。而且研究表明，氧濃度的高低不能影響NF-κB提高HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[29]，因此在低氧環(huán)境下的軟骨同樣存在NF-κB對(duì)HIF-1α的促進(jìn)作用?；钚匝躅愔饕獊碓从诰€粒體，是細(xì)胞氧化呼吸過程中的副產(chǎn)物，包括超氧化物、羥自由基(·OH)、過氧化物(H2O2等)和單態(tài)氧等[30]。活性氧類是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子，在HIF-1α缺氧條件下的調(diào)節(jié)作用機(jī)制復(fù)雜[25]。有研究表明，活性氧類不僅能維持細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α狀態(tài)穩(wěn)定[31]，還能通過激活NF-κB間接提高HIF-1α表達(dá)[32]。一氧化氮是維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)的重要物質(zhì)，可通過抑制脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域2的活性[33]使常氧下細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的降解減少[34-35]。同時(shí)一氧化氮和超氧化物之間的相互作用也介導(dǎo)HIF-1α調(diào)節(jié)。一方面，一氧化氮和超氧化物彼此反應(yīng)產(chǎn)生多種能夠硝化、亞硝化或氧化蛋白質(zhì)的活性中間體。另一方面，超氧化物導(dǎo)致內(nèi)源性一氧化氮介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)的翻譯后修飾減少，這些可變效應(yīng)導(dǎo)致在一氧化氮和超氧化物存在下HIF-1α穩(wěn)定性的差異調(diào)節(jié)[31]。

3 軟骨細(xì)胞Crabtree效應(yīng)

在高濃度葡萄糖的環(huán)境下，軟骨細(xì)胞的氧攝入量處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化效應(yīng)降低，導(dǎo)致細(xì)胞更多地依賴糖酵解合成ATP、生成乳酸。高濃度葡萄糖抑制細(xì)胞氧化磷酸化的這個(gè)現(xiàn)象被稱為Crabtree效應(yīng)。盡管研究者已經(jīng)提出了許多假設(shè)，但其觸發(fā)機(jī)制仍未知。Crabtree效應(yīng)的產(chǎn)生也可能是幾個(gè)因素相互作用的結(jié)果[36]。目前為大多數(shù)研究者所接受的假設(shè)是兩種糖酵解酶(磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶)和線粒體ATP酶對(duì)游離胞質(zhì)ADP的影響[36-37]。如果糖酵解過度活躍，其理論上可以超越線粒體ADP攝取，由于線粒體攝取的ADP是氧化磷酸化底物之一，這將限制ATP合酶作用的其他底物，繼而降低呼吸作用。不過因?yàn)榫€粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶的米氏常數(shù)是糖酵解酶百分之一[38]，糖酵解超越線粒體ADP的攝取量不可能在體內(nèi)發(fā)生，于是研究者得出結(jié)論，即使糖酵解酶增加糖酵解的活性，胞質(zhì)ADP仍將通過線粒體來提供能量。糖酵解酶使用Mg2+-螯合的核苷酸作為底物，而線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶的實(shí)際底物是非螯合的核苷酸，因此糖酵解和線粒體之間游離ADP供能的最終競爭將取決于螯合和非螯合ADP之間的比例。如果ADP或呼吸道底物保留在細(xì)胞質(zhì)中，則會(huì)導(dǎo)致呼吸通量下降。另一個(gè)提出的機(jī)制是線粒體外膜通過多孔通道的通透性調(diào)節(jié)膜和間質(zhì)底物的接觸，并以此來調(diào)節(jié)氧化磷酸化[39]。向?qū)rabtree效應(yīng)敏感的細(xì)胞中加入外部葡萄糖會(huì)在幾秒內(nèi)觸發(fā)氧氣消耗的部分抑制，從而抑制基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的從頭合成。來自全軟骨厚度的軟骨細(xì)胞在剝奪葡萄糖時(shí)表現(xiàn)出氧氣消耗增強(qiáng)，與Crabtree現(xiàn)象一致[40]。軟骨細(xì)胞存在的Crabtree效應(yīng)能顯著降低細(xì)胞的氧攝入量，以適應(yīng)不同軟骨層面的低氧環(huán)境，這可能是維持低氧低糖環(huán)境下軟骨細(xì)胞能量代謝的穩(wěn)態(tài)的重要途徑[41]。通過對(duì)不同層面上的軟骨細(xì)胞研究，研究者發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的氧攝入量大小與其所處的層面相關(guān)[42]：淺層軟骨細(xì)胞的氧攝入量比深層的細(xì)胞要少。Heywood小組做了更為詳細(xì)的研究設(shè)計(jì)，將同等數(shù)量的軟骨細(xì)胞分別暴露于低糖和高糖培養(yǎng)基下，同時(shí)檢測兩者的氧攝入量，發(fā)現(xiàn)在低糖環(huán)境下對(duì)氧的攝入量仍然顯著高于高糖環(huán)境[43]，而且高糖能有效抑制軟骨細(xì)胞的氧化磷酸化反應(yīng)，由此確定體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞同樣具有Crabtree效應(yīng)。

4 小 結(jié)

軟骨細(xì)胞在體內(nèi)處于低氧、低糖的環(huán)境下，細(xì)胞質(zhì)中的HIF-1α可以穩(wěn)定表達(dá)，從而進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β組成HIF-1；HIF-1能干擾三羧酸循環(huán)，因此HIF-1可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞在低氧低糖的環(huán)境中以糖酵解途徑獲取所需的ATP量，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。當(dāng)軟骨細(xì)進(jìn)入體外培養(yǎng)環(huán)境時(shí)，暴露在相對(duì)高濃度氧(21%)中，在一定時(shí)間內(nèi)，仍可以維持細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的穩(wěn)定性，所以軟骨細(xì)胞存在瓦氏效應(yīng)，Crabtree效應(yīng)與瓦氏效應(yīng)的表現(xiàn)一致，區(qū)別在于Crabtree效應(yīng)是由于高濃度的葡萄糖導(dǎo)致的，進(jìn)一步的研究中應(yīng)納入葡萄糖濃度這一因素，降低Crabtree效應(yīng)對(duì)瓦氏效應(yīng)的干擾，有助于更準(zhǔn)確地探究軟骨細(xì)胞的能量代謝與瓦氏效應(yīng)和Crabtree效應(yīng)的關(guān)系。同樣也可以研究骨關(guān)節(jié)炎患者合并糖尿病是否存在Crabtree效應(yīng)及其相互之間的關(guān)系。