隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展,干細(xì)胞已受到越來(lái)越多的關(guān)注,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),被證實(shí)具有多重分化潛能和廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,可對(duì)多種免疫細(xì)胞的增殖、凋亡、免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié),甚至對(duì)免疫細(xì)胞的遷移能力也有一定影響[1-3]。然而,近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn),MSCs在某些疾病的治療中會(huì)加劇組織纖維化的發(fā)生,嚴(yán)重影響治療效果。而MSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增從P1代即開(kāi)始老化,種子細(xì)胞的優(yōu)化與否直接影響細(xì)胞治療的質(zhì)量及安全[4]。近期研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了纖維化的發(fā)生發(fā)展,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的活化在干細(xì)胞纖維化轉(zhuǎn)化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[5-6]。本研究探討不同代次MSCs的生長(zhǎng)增殖、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化情況及其成纖維分化傾向,為MSCs成為再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞及臨床應(yīng)用提供更加充實(shí)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量60～70 g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。主要試劑:Dulbecco’s Modified eagle’s Medium (DMEM)低糖培養(yǎng)基、DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、羊抗小鼠IgG-Cy3二抗(Sigma-Aldrich Inc.,美國(guó));胎牛血清,新生牛血清(Gibco,新西蘭); RNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);PCR試劑盒(TransGen Biotech);Cell count kit 8(CCK-8,株式會(huì)社日本同仁化學(xué)研究所中國(guó)代表處);胰蛋白酶(0.25%),HEPES (C8H17N2O4SNa, 15 mmol/L),青霉素,鏈霉素，牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的原代培養(yǎng):二氧化碳窒息處死大鼠,無(wú)菌條件下分離股骨和脛骨,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓腔,獲得細(xì)胞懸液,經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾,收集細(xì)胞懸液,以1500 r/min,離心5 min,棄上清。用1∶4的PBS和ACK紅細(xì)胞裂解液破紅細(xì)胞,以1500 r/min,離心15 min,收集細(xì)胞。以1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板,采用含10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)48 h后首次換液,去除未貼壁細(xì)胞,之后每3 d換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合,消化細(xì)胞,傳代。

1.2.2 原代培養(yǎng)大鼠MSCs的鑒定:選用第3代MSCs,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合,胰酶消化后收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD79、CD90和CD133的表達(dá)。1×105個(gè)MSCs細(xì)胞一抗孵育37 ℃,2 h。PBS清洗3次,熒光素標(biāo)記的二抗37 ℃,避光孵育1 h,PBS清洗3次,FACSCalibur上機(jī)檢測(cè),數(shù)據(jù)通過(guò)Paint-A-Gate 和FloJo software軟件分析。

1.2.3 不同代次MSCs的增殖能力檢測(cè):將MSCs以1×106個(gè)/mL, 100μL/孔接種于96孔板內(nèi),每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)接種6個(gè)平行孔,分別于1～10代體外培養(yǎng)細(xì)胞傳代后第2天,每孔加入5 mg/mL MTT 25μL, 37 ℃孵育4 h后加入150μL DMSO后繼續(xù)孵育 30 min,置于酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)吸光值(OD)。以培養(yǎng)代次(1～10)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況:采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)不同代次MSCs中Wnt 通路相關(guān)蛋白,包括β-catenin、GSK-3β、CD14、pERK、pJNK。MSCs接種于T25培養(yǎng)皿,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)棄上清,4 ℃ PBS洗3次,每瓶加入800μL RIPA裂解液,冰浴30 min。12 000 r/min 離心5 min,收集上清。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,并調(diào)節(jié)各樣品至等濃度。按凝膠加樣緩沖液∶樣品=1∶4的比例加入5×凝膠加樣緩沖液。95 ℃水浴30 min。10%分離膠,加樣25μL, 80 V穩(wěn)壓電泳。收集分離膠,電壓20 V 半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。取出膜,放于封閉液(含5% 脫脂奶粉和0.3% BSA)中,4 ℃封閉過(guò)夜。一抗包被:37 ℃孵育2 h, PBST洗6次, 5 min/次。二抗包被:將膜分別浸入1∶10 000的帶HRP二抗。室溫孵育1 h后PBST漂洗6次。HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法,獲得蛋白印跡圖片,進(jìn)行圖像分析。一抗為兔抗,二抗為山羊抗兔,采用β-actin作為內(nèi)參。

1.2.5 不同代次MSCs中成纖維細(xì)胞分子標(biāo)記表達(dá):采用Realtime-PCR法檢測(cè)不同代次MSCs中成纖維細(xì)胞分子標(biāo)記Wimentin、TCF、α-SMA的表達(dá)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取MSCs細(xì)胞RNA,檢測(cè)RNA的含量和純度(OD 260/280),-70 ℃保存待用。PCR過(guò)程:采用軟件Primer Express設(shè)計(jì)引物(表1),探針5′端標(biāo)記FAM,3′端標(biāo)記。采用一步法分別擴(kuò)增各目的片段。10μL PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:56 ℃ 10 min,95 ℃變性2 min,95 ℃ 15 s,62 ℃ 45 s,42個(gè)循環(huán),28 ℃ 5 min。在62 ℃退火階段檢測(cè)熒光信號(hào),FAM通道檢測(cè)熒光,CT值≤38判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),組間計(jì)量資料均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 第1代MSCs體外培養(yǎng)7 d后,相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞貼壁,呈卵圓型或長(zhǎng)梭形,出現(xiàn)旋渦狀集落式生長(zhǎng)。培養(yǎng)約14 d后,MSCs可達(dá)到80%融合,經(jīng)過(guò)3～4次傳代,MSCs增殖速度明顯加快,細(xì)胞傳代后3～4 d即可達(dá)到80%融合,且形態(tài)較均一;培養(yǎng)第9代時(shí)細(xì)胞增殖加快,形態(tài)不一(圖1)。體外培養(yǎng)的P3代MSCs增殖速度快,形態(tài)均一,故選擇P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面分子標(biāo)記。結(jié)果顯示,MSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD29, 不表達(dá)CD79、CD34、CD45、CD133。

表1 PCR引物表

A:原代培養(yǎng)MSCs 14 d;B:P3代大鼠MSCs;C:P5代大鼠MSCs;D:P7代大鼠MSCs;E: P9代大鼠MSCs圖1 原代及傳代培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs (×100相差顯微鏡)

2.2 不同代次MSCs的增殖情況 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)MSCs,第1代、第2代增殖能力較弱,第3代后的增殖能力顯著增強(qiáng),見(jiàn)圖2。

圖2 MTT檢測(cè)GFP 轉(zhuǎn)染MSCs增殖活力圖

2.3 Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 經(jīng)圖像分析,與P0代MSCs相比,P3～P7代MSCs中,5種被檢Wnt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異;而P9代MSCs中,5種被檢Wnt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著上調(diào),見(jiàn)圖3。

2.4 不同代次MSCs中成纖維細(xì)胞分子標(biāo)記表達(dá) 與P0代MSCs相比,P3、P5代MSCs中,幾種被檢測(cè)的成纖維細(xì)胞分子標(biāo)記的mRNA表達(dá)變化均無(wú)顯著差異;P7代MSCs中,成纖維細(xì)胞分子標(biāo)記Wimentin的mRNA表達(dá)顯著上調(diào),P9代MSCs中,Wimentin、TCF、α-SMA的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào),見(jiàn)圖4。

注:與P0代比較,*P<0.05圖3 Western Blot檢測(cè)不同代次MSCs Wnt信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

注:與P0代比較,*P<0.05圖4 Realtime-PCR法檢測(cè)纖維細(xì)胞分子標(biāo)記表達(dá)的情況

3 討論

MSCs因其取材方便,自我復(fù)制能力強(qiáng),在體外具有很強(qiáng)的增殖能力,同時(shí)具有良好的可塑性等特性,已成為組織工程學(xué)研究和臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療首選[7],為醫(yī)學(xué)界攻克這些人類疑難病癥帶來(lái)了希望[8]。但有研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)MSCs有時(shí)不僅會(huì)因衰老使細(xì)胞增殖能力顯著降低或增生分化功能減低,還可能出現(xiàn)纖維化分化傾向,使骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞受到限制。為了使MSCs 更好、更持久地應(yīng)用于臨床修復(fù)組織細(xì)胞和器官,在移植前評(píng)估細(xì)胞的生物活性顯得尤為重要。

本研究取大鼠骨髓,原代分離培養(yǎng)MSCs,分離效率高,細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞表面標(biāo)記符合干細(xì)胞特性,細(xì)胞傳代穩(wěn)定。隨著體外培養(yǎng)代次的增加,MSCs的細(xì)胞形態(tài)由排列整齊的長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng),逐漸變?yōu)榫W(wǎng)狀的短梭形,細(xì)胞體積變大,旋渦狀消失,排列雜亂,易于消化。觀察 P1～P10 代次細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示 P3 代之后細(xì)胞的增殖能力明顯高于 P1、P2 代,本研究中的細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果與生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果高度吻合,與Wagner等[9]的研究結(jié)果一致。MSCs的衰老,可導(dǎo)致其分化能力減低,隨著體外培養(yǎng)代次的增加,細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生一系列改變,細(xì)胞的分化傾向有明顯改變。Polo等[10]認(rèn)為干細(xì)胞連續(xù)傳代會(huì)逐漸改變供體細(xì)胞表觀遺傳學(xué)信息,進(jìn)而可能影響其分化傾向,但其具體分子機(jī)制尚不明確。MSCs衰老還可能導(dǎo)致其分化能力受損,Kim等[11]發(fā)現(xiàn)不同代次的MSCs成骨分化能力不同,6代以后明顯減弱,該研究認(rèn)為作為組織工程種子細(xì)胞不宜超過(guò)5代。

近期研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了多種組織纖維化的發(fā)生與發(fā)展[12-13]。提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的活化在干細(xì)胞成纖維化分化的過(guò)程中可能有重要作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨細(xì)胞培養(yǎng)代次的增加,細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)逐步增強(qiáng),在P9代細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化與多個(gè)器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。本研究在MSCs體外培養(yǎng)P9代細(xì)胞中也檢測(cè)到了成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記,證實(shí)MSCs體外培養(yǎng)P9代已出現(xiàn)成纖維分化傾向。

總而言之,不同代次的MSCs具有不同的分化異質(zhì)性。本研究結(jié)果顯示作為種子細(xì)胞不宜超過(guò)P9代, P3～P7代具有純度高、倍增快等優(yōu)點(diǎn),是能夠滿足組織工程細(xì)胞植入的種子細(xì)胞。從干細(xì)胞治療的質(zhì)控要求考慮,宜選擇P3～P7代次MSCs為佳。