郭田順 袁梟龍 丁 勇*

1.河北省張家口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北張家口075000；2.河北省懷安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北懷安076150

布魯氏桿菌病是一種人畜共患病，近年來，在牛、羊中流行呈增長趨勢，布病是急性傳染病，也是職業(yè)病，布魯氏桿菌為細(xì)小的球桿菌，革蘭氏染色陰性。布魯氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷方式最常用的有：

1）平板凝集虎紅試驗(yàn)（虎紅平板凝集試驗(yàn)）：操作簡單快速、價(jià)格便宜。

2）試管沉淀，試管凝集試驗(yàn)（確診方法）：血清凝集滴度（價(jià)）在1∶50以上為陽性，l∶25 為可疑，可疑多在3～4 周后采血重檢。如仍為可疑，則列為陽性。操作相對復(fù)雜、方法繁瑣費(fèi)事、反應(yīng)時(shí)間長。

3）布魯氏桿菌的試紙條（膠體金試紙條）：快速反應(yīng)診斷，這是近幾年出現(xiàn)的快速診斷方法。

4）ELISA：簡單、快速、敏感性高、特異性高、結(jié)果易于判定、易于標(biāo)準(zhǔn)化、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測。但需要時(shí)間長，一般不采用本方法。

為了準(zhǔn)確診斷本病，筆者做了許多對比試驗(yàn)（6 538 頭奶牛和1 368 只羊）。

1 材料與方法

1.1 試劑

虎紅凝集布魯氏桿菌抗原、布魯氏桿菌陽性血清、試管沉淀凝集布魯氏桿菌抗原（與陽性抗原）、布魯氏桿菌快速反應(yīng)試紙條，布魯氏桿菌ELISA試劑反應(yīng)盒。

1.2 方法

平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、快速反應(yīng)試紙條、布魯氏桿菌ELISA 試劑反應(yīng)盒（結(jié)果對比與分析）。

1）平板凝集試驗(yàn)（包括玻璃片或特制塑料平板或紙質(zhì)一側(cè)加塑料膜的反應(yīng)板）：取奶牛血清滴1 滴于反應(yīng)板上，再加入1 滴虎紅凝集抗原用牙簽或火柴攪拌均勻，3～5 min 開始觀察，觀察結(jié)果共計(jì)6 538例，出現(xiàn)假陰性6例，陽性12例，可疑（即**或*凝集度）32 份。

2）布魯氏桿菌抗體快速檢測卡具有方便、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，缺點(diǎn)是價(jià)格貴，增加養(yǎng)殖成本，適用于現(xiàn)場大批量樣品檢測，包括快速檢測卡、滴管、稀釋液，取出檢測卡，開啟后平放于操作臺(tái)上，將待檢樣品滴入點(diǎn)樣孔，再加2 滴樣品稀釋液于樣品孔中，加樣5 min 后，觀察顯色區(qū)，陰性為C 線顯色，T線不顯色，陽性為C 線顯色，T 線肉眼觀察，無論顏色深淺均判陽性，無效為C 線不顯色，T 線無論顯色或不顯色，都判無效。注意檢測卡開啟后，1 h 內(nèi)必須使用，不能重復(fù)使用，滴加稀釋液后30 s 內(nèi)，在顯色區(qū)無液體移動(dòng)再補(bǔ)滴1 滴稀釋液。檢查結(jié)果較精準(zhǔn)，結(jié)果：38 份陽性，12 份可疑，反復(fù)做2 次結(jié)果相同。

3）試管凝集試驗(yàn)法或96 孔反應(yīng)板凝集試驗(yàn)法（可參照雞ND96 孔凝集反應(yīng)）：將分離出的被檢血清用PBS液作連續(xù)倍比稀釋，加入1 滴試管凝集抗原，放置在一定室溫和一定時(shí)間觀察各種稀釋度的凝集效價(jià)。

具體操作為：①取小試管9 只排列于試管架上，自左至右順序?yàn)?～9 號(hào)；②于第1 管內(nèi)加PBS液0.9 mL，從2～9 只試管各加入PBS 液0.5 mL；③用移液管吸取被檢血清0.1 mL，加在第1 只試管內(nèi)混和均勻后，吸出0.5 mL，加入第3 只試管，如此連續(xù)稀釋至第7 只試管，混和均勻后吸出0.5 mL 棄去，第8 只試管加0.5 mL 1∶50稀釋的診斷血清，為陽性對照，第9 只試管加入PBS 液0.5 mL 為陰性對照。血清的稀釋順序?yàn)?∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 及1∶640；④于上述試管內(nèi)，均加入試管凝集布魯氏桿菌病診斷液，搖晃震動(dòng)試管架數(shù)分鐘，使反應(yīng)液混和均勻；⑤將試管架放置37℃經(jīng)18～24 h 觀察結(jié)果；⑥按反應(yīng)強(qiáng)弱記錄結(jié)果，并用“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、“++++”作凝集程度的標(biāo)記?！?+++”全部凝集，上層液體透明。稱“100%”凝DN，“+++”明顯凝集，上層液體基本透明，或稱75%凝集；“++”上層液體較渾濁，但試管底可見凝集沉淀，或稱25%凝集；“+”可凝反應(yīng)，“-”不凝集，陰性反應(yīng)。出現(xiàn)陽性38 份，可疑12 份。

4）ELISA。酶聯(lián)反應(yīng)是在免疫學(xué)的基礎(chǔ)上，利用抗原、抗體的特異性，其反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的新技術(shù)?？乖c抗體的反應(yīng)是在聚苯乙烯96 孔微量反應(yīng)板內(nèi)進(jìn)行，每加入一種試劑作用后，經(jīng)過多次洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，其特異性與穩(wěn)定性得以保證。在試驗(yàn)中主要有：間接法檢測抗體、夾心法檢測抗原的雙抗體以及競爭法檢測小分子抗原或半抗原的抗體等，比較常用的是夾心法與間接法。測定操作非常簡單，有標(biāo)本的收集、保存、準(zhǔn)備試劑、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果報(bào)告和結(jié)果判斷及解釋等，每個(gè)步驟都要操作精細(xì)，如有不當(dāng)都會(huì)影響測定結(jié)果，加樣、溫育和洗板3個(gè)步驟最重要。最為常用檢測樣品是血清（漿）、唾液（用于特定的檢測目的）、腦脊液、尿液、糞等。

具體操作步驟如下：

①包被（注意設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照）。將使用抗原用包被稀釋液稀釋到使用濃度按照說明書用量來操作，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，或4℃放置24 h；將孔中液體甩掉棄去（板上加蓋或?qū)迤椒旁诘撞坑袧窦啿嫉慕饘贊窈兄?，其目的是防止水分快速蒸發(fā)）。

②酶標(biāo)反應(yīng)孔的封閉。用配制消毒好的5%健康小牛血清滴入孔內(nèi)置37℃恒溫箱封閉40 min，封閉液加滿各反應(yīng)孔，各孔中不要有氣泡出現(xiàn)，封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3 遍，每遍洗滌3 min。洗滌方法：吸干孔內(nèi)反應(yīng)液，將洗滌液注滿板孔，放置2 min 略作搖動(dòng)，吸干孔內(nèi)液，傾去液體后在吸水紙上拍干，洗滌次數(shù)3 次。

③加入待檢測樣品。檢測時(shí)一般采用1∶200的稀釋度，將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每個(gè)樣品至少加雙孔，每孔100 μL，置于37℃恒溫箱40～60 min。用洗滌液滿孔洗滌3 遍，每遍3 min。

④加入酶標(biāo)抗體。酶標(biāo)抗體：根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進(jìn)行，37℃，30～60 min（＜30 min 往往結(jié)果不穩(wěn)定），每孔加100 μL，洗滌同前。

⑤加入底物液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。首選TMB—過氧化氫尿素溶液，OPD—過氧化氫底物液系統(tǒng)次之。底物加入量：每孔100 μL，置37℃避光放置3～5 min，加入終止液顯色。

⑥終止反應(yīng)。每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)，于20 min 內(nèi)測定試驗(yàn)結(jié)果。

⑦結(jié)果判斷。OPD 顯色后采用492 nm 波長，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450nm波長。檢測時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均值的比值（P/N）表示，當(dāng)P/N＞2 時(shí)作為抗體的效價(jià)（數(shù)值的大小依具體檢測要求而定）。陽性46 份，可疑4 份。

3 結(jié)果分析

4種方法中，平板凝集是定性判斷，準(zhǔn)確度略低；試管凝集是定量判斷，準(zhǔn)確度較高，與近幾年紙片快速診斷相近，但準(zhǔn)確度略低；紙片快速診斷是實(shí)驗(yàn)室中診斷布魯氏桿菌病較準(zhǔn)確的方法之一，為凈化布魯氏桿菌病提供了有力手段。

4 結(jié)語

近年來，隨著奶牛業(yè)發(fā)展，對布魯氏桿菌的凈化力度不夠，造成奶牛小區(qū)布病增多，其主要原因：一方面是經(jīng)濟(jì)利益所致，只為數(shù)量，不要求質(zhì)量；另一方面相關(guān)部門把關(guān)不夠。解決措施：①加強(qiáng)學(xué)習(xí)，讓人們了解本病的危害性，提高認(rèn)識(shí)；②加大投入，對檢出病牛強(qiáng)制性撲殺；③提高凈化力度，做到應(yīng)檢盡檢；④相關(guān)部門緊密配合，上下聯(lián)動(dòng)打贏布病凈化攻堅(jiān)戰(zhàn)。