汪普求,謝芬高，文航華，曹 俊，張希洲

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，湖北 宜昌 443000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，又名卒中、腦血管意外，由于腦部血管突然破裂或血管阻塞導(dǎo)致大腦嚴(yán)重缺血缺氧而引起腦組織損傷，并出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)，如額紋消失、口角歪斜、吐詞不清、一側(cè)肢體癱瘓、感覺異常等，包括缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中(hemorrhagic stroke，HS)，其中以IS最為常見，占腦卒中總數(shù)的60%～70%,是世界范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈RNA小分子，由22～24個(gè)核苷酸組成，主要存在于真核細(xì)胞中，參與真核生物轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[2]。miRNA是內(nèi)源性表達(dá)的RNA分子，在調(diào)控IS的病理生理過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在促進(jìn)血管生成、神經(jīng)形成和神經(jīng)保護(hù)等方面可能具有重要作用，一些miRNA及其靶基因被認(rèn)為參與神經(jīng)損傷修復(fù)[3]。miRNA最初從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄，而RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)初級(jí)miRNA的轉(zhuǎn)錄。miRNA的生物學(xué)功能非常依賴細(xì)胞背景，故miRNA與腦卒中之間的確切聯(lián)系應(yīng)該只在特定的細(xì)胞環(huán)境中討論。有研究表明，miRNA在腦缺血和相關(guān)疾病的分子過程中充當(dāng)關(guān)鍵介質(zhì)作用[4]?，F(xiàn)對(duì)miRNA在IS的作用予以綜述。

1 IS的病理生理學(xué)改變

IS的病理生理學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，尚未完全清楚。目前研究較為明確的機(jī)制主要是缺血性興奮性毒性、相關(guān)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。當(dāng)大腦供血障礙時(shí)，腦組織出現(xiàn)供能及供氧障礙，腦細(xì)胞進(jìn)行無氧代謝并產(chǎn)生大量乳酸，過多的乳酸堆積導(dǎo)致代謝性酸中毒，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死。細(xì)胞缺氧及能量和ATP生成不足，Na+，K+-ATP泵功能異常，一方面，因細(xì)胞內(nèi)外離子及水平衡失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)Na+增多、水鈉潴留而出現(xiàn)細(xì)胞水腫；另一方面，可出現(xiàn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸)釋放并激活相關(guān)受體，產(chǎn)生缺血性興奮性毒性作用，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡[2]。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)能的主要細(xì)胞器，腦缺血時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生過多氧自由基，并激活促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，進(jìn)而出現(xiàn)線粒體功能障礙，氧化呼吸鏈中關(guān)鍵酶活性降低，氧化呼吸鏈中斷，導(dǎo)致產(chǎn)能不足，最終出現(xiàn)腦細(xì)胞能量匱乏而死亡。

2 miRNA在干預(yù)IS中的作用

近幾十年，腦卒中的臨床診斷方法主要以CT、磁共振成像、腦血管造影、超聲等影像學(xué)檢查為主，其特異性和區(qū)分急性腦卒中及其相關(guān)危險(xiǎn)因素的能力尚不清楚，診斷和判斷預(yù)后的能力有限且成本較高。腦卒中溶栓治療時(shí)間窗(6 h內(nèi))的限制使人們不斷探索新的可用于早期診斷及治療腦卒中的生物標(biāo)志物。研究表明，miRNA有望成為符合要求的生物標(biāo)志物[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些miRNA可用于IS的診斷及預(yù)后判斷。

2.1miRNA與缺血性興奮性毒性 缺血性興奮性毒性指組織在缺血后興奮性神經(jīng)遞質(zhì),如谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)等產(chǎn)生過多，造成神經(jīng)細(xì)胞死亡。IS最初腦組織損傷是由于缺血性興奮性毒性導(dǎo)致的。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量較高的最具代表性的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。IS早期，谷氨酸與突觸后非NMDA受體結(jié)合，引起Na+通道開放，大量Na+內(nèi)流，同時(shí)伴隨Cl-和水內(nèi)流，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、溶解，甚至變性壞死。此外，谷氨酸與NMDA受體結(jié)合，Ca2+通道開放，大量Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，激活相應(yīng)的Ca2+依賴型酶類及磷脂酶類，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter 1，GLT-1)負(fù)責(zé)大部分細(xì)胞外谷氨酸的清除，對(duì)預(yù)防大腦缺血性興奮性毒性具有重要作用[5]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-124a表達(dá)可顯著降低GLT-1表達(dá)水平，使腦組織谷氨酸水平增加，間接說明miR-124a參與腦缺血性興奮性毒性作用調(diào)節(jié)[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，miR-29a、miR-181a在星形膠質(zhì)細(xì)胞中含量較高且能調(diào)控GLT-1表達(dá)，能通過特殊的靶基因作用于一些重要的細(xì)胞生存/死亡通路，保護(hù)IS所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷[7-8]。過量的谷氨酸通過激活突觸外NMDA受體亞基1/NMDA 2B亞基和代謝型谷氨酸受體1，導(dǎo)致鈣超載和細(xì)胞死亡[9]。過量表達(dá)的miR-223減輕NMDA誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，保護(hù)IS所致海馬神經(jīng)元興奮性神經(jīng)細(xì)胞死亡[10]。此外，還有一些miRNA參與缺血性興奮性毒性的調(diào)節(jié)，如miR-125b、miR-263a、miR-194等通過減少突出間隙谷氨酸的積累、抑制離子通道的開放等減輕缺血所致的興奮性毒性作用。

2.2miRNA與缺血性氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激參與機(jī)體許多生理病理過程，氧化應(yīng)激性損傷是缺血性腦損傷和神經(jīng)細(xì)胞死亡的基本機(jī)制之一。核轉(zhuǎn)錄因子2(nuclear transcription factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是目前研究較多的信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原反應(yīng)平衡方面具有重要作用，同時(shí)也是腦組織缺血/再灌注損傷細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要機(jī)制之一[11]。超氧化物歧化酶是一種內(nèi)源性抗氧化酶，可快速有效滅活超氧陰離子，減輕組織損傷，有助于促進(jìn)IS再灌注損傷的恢復(fù)。谷胱甘肽是機(jī)體內(nèi)重要的小分子肽物質(zhì)，具有抗氧化和清除氧自由基的作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA直接或間接參與Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，miR-93拮抗劑通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路減輕缺血性腦組織損傷[12]。miR-210能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平參與調(diào)節(jié)IS時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕腦組織損傷[13]。腦缺血時(shí)，環(huán)加氧酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可促進(jìn)活性氧類的產(chǎn)生。正常情況下，COX-2表達(dá)量很少，腦缺血可誘導(dǎo)COX-2在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a能抑制COX-2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的表達(dá)[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miR-424的過度表達(dá)能保護(hù)短暫性局灶性腦缺血/再灌注損傷，同時(shí)抑制過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷[15]。miRNA通過改變相關(guān)酶類表達(dá)，從而起到保護(hù)或促進(jìn)缺血性腦損傷作用，使miRNA可能成為潛在的用于改善IS后氧化應(yīng)激的新型治療藥物。

2.3miRNA與缺血后炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)是IS病理生理過程的重要環(huán)節(jié)之一。缺血性腦損傷的炎癥反應(yīng)由多種細(xì)胞、炎性因子、趨化因子、活性氧類、損傷相關(guān)分子模式、自身抗體等共同參與[16]。研究表明，miR-424能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而保護(hù)缺血性腦卒中所致的神經(jīng)組織細(xì)胞損傷[17]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),能激活核因子κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)促炎基因、細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)。目前，已發(fā)現(xiàn)多種TLR，并且發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路參與缺血后炎性損傷的調(diào)節(jié)。TLR4是小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-181c的直接作用靶點(diǎn)，可下調(diào)TRL4的表達(dá)，此外，miR-181c還可抑制核因子κB的活化以及促炎因子的產(chǎn)生[18]。miR-155通過上調(diào)TLR4表達(dá)同時(shí)抑制炎性介質(zhì)(細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1、髓系分化初級(jí)反應(yīng)基因88)表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β表達(dá)[19]。還有一些miRNA參與腦缺血后炎癥調(diào)控，如miR-146a、miR-106a、miR-124、miR-9和miR-219等，通過改變其表達(dá)水平調(diào)節(jié)相應(yīng)的炎性因子表達(dá)，起到促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)作用。

2.4miRNA與缺血細(xì)胞凋亡 凋亡、壞死和壞疽是IS發(fā)病的3種細(xì)胞死亡類型。細(xì)胞凋亡是基因控制下細(xì)胞自主有序的死亡，有助于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在某些病理情況(如卒中)可加速細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，涉及一系列的基因激活、表達(dá)等，其中有許多信號(hào)通路及化學(xué)途徑參與，如膜蛋白受體通路(Fas/FasL)、胱天蛋白酶(caspase)途徑。氧葡萄糖剝奪/再灌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻鳎現(xiàn)as是miR-25作用靶點(diǎn)，且miR-25能抑制Fas/FasL途徑活化，從而減輕腦卒中后細(xì)胞凋亡[20]。caspase-3在細(xì)胞凋亡中起不可替代的作用，其表達(dá)量增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，miR-99a抑制cspase-3前體蛋白表達(dá)及caspase-3的活化，同時(shí)預(yù)防IS后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21]。miR-let-7c-5p能抑制caspase-3表達(dá)，從而減少腦缺血所致細(xì)胞凋亡[22]。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)基因可以抑制由多種細(xì)胞毒因素引起的細(xì)胞死亡。miR-9能特異性調(diào)控Bcl-2l11表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡[23]。Bcl-2和Bcl-xL蛋白是減輕缺血后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。急性缺血性腦卒中后，miR-106b-5p表達(dá)量明顯增加，并直接作用于髓細(xì)胞白血病1蛋白。髓細(xì)胞白血病1蛋白是Bcl-2家族成員之一，是DNA損傷后調(diào)控細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子[24]。組蛋白去甲基化酶10是一種抗凋亡因子，其表達(dá)受miRNA調(diào)控，急性IS時(shí)，miR-146a表達(dá)量顯著下降，miR-146a能顯著上調(diào)組蛋白去甲基化酶10表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[25]。熱激蛋白(heat shock protein，HSP)A12B是HSP70家族成員之一，參與缺血后神經(jīng)組織凋亡的調(diào)控[26]。有報(bào)道m(xù)iR-134在IS中起重要作用，可負(fù)向調(diào)控HSPA12B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[27]。此外，還有一些miRNA參與缺血后腦細(xì)胞凋亡的調(diào)控，如miR-323、miR-9、miR-124、miR-497等均通過改變其表達(dá)量參與細(xì)胞卒中后腦細(xì)胞凋亡。

2.5miRNA在腦卒中的潛在治療作用 IS發(fā)病率居高不下，且呈年輕化趨勢(shì)，針對(duì)IS的治療藥物十分有限，最有效的治療藥物主要是重組組織型纖溶酶原激活劑[28]。而重組組織型纖溶酶原激活劑只適用于急性IS的溶栓制劑，治療時(shí)間窗短，一般只用于IS發(fā)病6 h內(nèi)，因此僅適用于10%的IS患者。溶栓治療存在許多局限性和不良反應(yīng)，其中主要不良反應(yīng)是可增加出血風(fēng)險(xiǎn)，故需要挖掘其他可用于治療IS的新制劑。miRNA是一種能調(diào)控機(jī)體某些潛在有毒基因表達(dá)的內(nèi)源性分子，故可作為一種潛在用于治療IS的生物制劑。miRNA參與神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)神經(jīng)形成、血管生成等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)IS患者腦組織損傷修復(fù)，降低病死率，提高遠(yuǎn)期生存質(zhì)量。

2.5.1神經(jīng)保護(hù)作用 水通道蛋白4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的通道蛋白。IS發(fā)作時(shí)，水通道蛋白4表達(dá)量增加，使大量水通道開放，過多水分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫，最終出現(xiàn)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)的miR-29b能抑制水通道蛋白4的表達(dá)，從而縮小腦梗死面積，減輕腦水腫，減輕血腦屏障損傷[29]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-497的表達(dá)，使腦缺血區(qū)Bcl-2及Bcl-W蛋白表達(dá)量增加，從而減輕IS，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷，間接起到保護(hù)神經(jīng)組織的作用[30]。腫瘤壞死因子作用因子3已被證實(shí)為缺血性級(jí)聯(lián)信號(hào)中央調(diào)制器，包括神經(jīng)元死亡、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激[31]。有實(shí)驗(yàn)表明，miR-455通過抑制腫瘤壞死因子作用因子3表達(dá)，減輕大腦中動(dòng)脈閉塞所致的神經(jīng)元細(xì)胞缺血缺氧性的腦組織損傷[32]。此外，其他miRNA(miR-181a、miR-21、miR-347、miR-124等)通過相應(yīng)的途徑直接或間接參與缺血后神經(jīng)保護(hù)，故這些miRNA有望成為潛在的診斷IS的生物標(biāo)志物和治療腦缺血的生物制劑。

2.5.2神經(jīng)形成 神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持依賴結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)其增殖、分化、發(fā)育需多種重要物質(zhì)參與，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子是重要小分子物質(zhì)之一。血管內(nèi)皮生長因子是一種促進(jìn)血管生成的神經(jīng)形成營養(yǎng)因子，IS過度表達(dá)的miR-210能上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)成年小鼠腦內(nèi)神經(jīng)形成[33]。miR-124a通過激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)缺血后神經(jīng)形成[34]。其他一些miRNA也參與神經(jīng)形成，如miR-9可促進(jìn)人類神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，miR-17-92通過糖皮質(zhì)激素信號(hào)通路影響神經(jīng)形成，可見，miRNA的藥理調(diào)控作用可能是缺血后神經(jīng)形成的潛在機(jī)制。

3 小 結(jié)

miRNA在IS的病理生理過程、診斷及潛在治療效果等方面均發(fā)揮重要作用，使基于miRNA的新型生物制劑具有很大的應(yīng)用前景。目前，miRNA的研究多停留在動(dòng)物水平，如何成功將其轉(zhuǎn)化為人體水平的研究仍是一大難題。針對(duì)miRNA靶向劑的研發(fā)仍面臨較多困難，譬如,如何維持其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、藥動(dòng)學(xué)、定向有效組織分布等。隨著研究的不斷深入，期待miRNA靶向劑能順利生產(chǎn)并更好地應(yīng)用于臨床，挽救更多患者的生命。