闞曉麗，李澤龍，王 予，陳穎坤，王嚴影，曹現(xiàn)寶※

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，昆明 650500； 2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頜面外科b.臨床實驗科，昆明 650032)

近年來，呼吸道變應(yīng)性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、哮喘等嚴重威脅人類健康[1]。呼吸道變應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展伴隨復(fù)雜的病理改變，目前還未發(fā)現(xiàn)能夠徹底治療該類疾病的相關(guān)藥物或技術(shù)。但可以確定呼吸道變應(yīng)性疾病屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，主要包括早期炎癥級聯(lián)反應(yīng)和后期遲發(fā)相反應(yīng)，其中各型免疫細胞的活化是促進疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多功能干細胞，已在骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶和肌肉等組織的損傷修復(fù)方面表現(xiàn)出治療潛力。越來越多的動物實驗和初步臨床試驗證據(jù)表明，MSCs不僅具有多能分化潛能，還可通過與T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的相互作用表現(xiàn)出強大的免疫調(diào)節(jié)潛能[2-3]。MSCs對機體的免疫調(diào)節(jié)作用使其成為治療變應(yīng)性疾病的理想藥物，通過調(diào)節(jié)免疫細胞的活化，抑制變態(tài)反應(yīng)，從而控制疾病進展?，F(xiàn)就近年來MSCs與呼吸道變應(yīng)性疾病的相關(guān)研究進展予以綜述。

1 MSCs調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增殖和功能

T淋巴細胞是細胞免疫的主要執(zhí)行者，在促進變態(tài)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，MSCs可調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增殖，參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。Giuliani等[4]發(fā)現(xiàn)，當骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)與T細胞共培養(yǎng)時，BM-MSCs可通過抑制T細胞進入細胞周期而影響T細胞增殖，并能有效地誘導(dǎo)白細胞介素(interleukin，IL)10的產(chǎn)生，促進T細胞的凋亡。Lim等[5]對延遲型變態(tài)反應(yīng)(delayed-type hypersensitive，DTH)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs往往優(yōu)先聚集在引流淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)及生發(fā)中心的邊緣處，并以劑量依賴性方式誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)周圍免疫細胞的凋亡來減弱DTH。DTH過程中，炎癥反應(yīng)區(qū)域T細胞的浸潤明顯減少，而引流淋巴結(jié)中T細胞的凋亡顯著增加；進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs引起T淋巴細胞凋亡的機制與其對一氧化氮的誘導(dǎo)有關(guān)，表明MSCs可通過直接影響T淋巴細胞的增殖與凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，減輕局部組織損傷。

2 MSCs調(diào)節(jié)B細胞的增殖和功能

早期為研究MSCs對B淋巴細胞的相互作用，Corcione等[6]將人BM-MSCs與B淋巴細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs能直接將B淋巴細胞阻滯于G0/G1期，從而抑制其增殖；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs發(fā)揮上述作用與其抑制免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M、IgG和IgA的分泌，下調(diào)CXC趨化因子受體4、CXC趨化因子受體5、CC趨化因子受體7、CXC趨化因子配體12和CXC趨化因子配體13的表達有關(guān)。在粉塵螨誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源MSCs可以顯著促進特應(yīng)性皮炎小鼠毛發(fā)生長，并以劑量依賴性方式抑制病變處表皮增生和B淋巴細胞浸潤，降低血清IgE水平；并在隨后進行的共培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源MSCs通過抑制環(huán)加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)信號通路實現(xiàn)對B淋巴細胞增殖和成熟的抑制[7]。另有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人類臍帶及脂肪來源的MSCs均具有抑制B細胞增殖和分化的作用?？梢?，不同組織來源的MSCs均可通過抑制B細胞的增殖和分化來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8-9]。

3 MSCs對DC的作用

MSCs對先天或后天免疫細胞均有抑制作用，DC是其中之一。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的研究中，腹腔注射從模型小鼠脾臟分離出的DC能夠加劇潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸的炎性病變，而BM-MSCs處理組小鼠脾臟分離出的DC則能顯著降低炎癥活動指數(shù)，改善組織病理學(xué)評分；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs可通過升高半乳糖凝集素3的表達，降低DC中IL-1β、IL-12和IL-6的濃度，并降低其膜表面抗原呈遞分子的表達[10]。除間接作用外，MSCs還能以直接接觸的方式抑制DC功能。Alidinucci等[11]發(fā)現(xiàn)，MSCs與DC接觸可改變其細胞骨架組織干擾激活過程，使DC在擴增的同時保留未成熟的特征，從而無法有效參與T細胞的免疫調(diào)節(jié)。而Spaggiari等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs存在的條件下，即使補充外源性的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和IL-4也不能使從外周血分離出的單核細胞中獲得典型成熟的DC表型并產(chǎn)生促炎介質(zhì)IL-12，更不能誘導(dǎo)T淋巴細胞活化或增殖，證明MSCs具有抑制早期DC成熟的作用。綜上所述，MSCs除間接或直接接觸方式對DC的調(diào)控外，還可通過抑制DC的成熟，進而抑制下游炎性通路的活化。

4 MSCs與NK細胞的相互作用

MSCs與NK細胞的相互作用及其機制對MSCs的推廣應(yīng)用至關(guān)重要。Najar等[13]通過共培養(yǎng)包皮間充質(zhì)干細胞(foreskin mesenchymal stromal cells，F(xiàn)SK-MSCs)和NK細胞驗證其相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞的活化對FSK-MSCs表現(xiàn)出不均勻的細胞毒性，最終導(dǎo)致其死亡。絲氨酸蛋白酶抑制劑是機體中絲氨酸蛋白酶的活性調(diào)控因子之一，可調(diào)節(jié)生物體中許多重要的生命過程(補體激活、炎癥和細胞遷移等)。在激活的NK細胞中，F(xiàn)SK-MSCs介導(dǎo)的C1和B9絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達明顯降低。此外，F(xiàn)SK-MSCs能抑制NK細胞的增殖，但卻增加了γ干擾素和腫瘤壞死因子α的表達，并增強NK細胞的去顆?；饔靡约按┛姿睾皖w粒酶的分泌。Giuliani等[14]的研究同樣證實了MSCs對NK細胞增殖和溶解細胞功能具有顯著的抑制作用，MSCs可通過下調(diào)不同激活標記和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號的表達，阻斷NK細胞的細胞溶解機制，從而使其與靶細胞形成免疫突觸，并分泌細胞毒物顆粒。其他類似研究也顯示，臍帶來源的MSCs與NK細胞接觸可引起IL-1途徑活化，隨后引起前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的大量分泌，導(dǎo)致NK細胞活性降低，并抑制其細胞毒作用[15]。由此可見，MSCs對NK細胞具有雙重作用，可通過多種機制抑制NK細胞活性，降低細胞毒作用，抑制炎癥反應(yīng)；并在一定程度上增強γ干擾素等因子的表達，發(fā)揮一定的促炎作用。

5 MSCs與呼吸道變應(yīng)性疾病

呼吸道的變應(yīng)性疾病主要包括上呼吸道的AR和下呼吸道的哮喘，上呼吸道和下呼吸道解剖學(xué)上的連貫性導(dǎo)致AR與哮喘經(jīng)常共存，稱為聯(lián)合氣道疾病[16]。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)病機制也與變態(tài)反應(yīng)性炎癥有關(guān)[17]。

5.1AR AR是一種慢性復(fù)發(fā)性過敏性炎癥，由變應(yīng)原接觸過度激活的輔助性T細胞(helper T cell，Th)2引起，主要表現(xiàn)為流鼻涕、鼻癢、打噴嚏和鼻塞。病理組織學(xué)顯示，活動性AR患者的鼻黏膜上皮內(nèi)可見肥大細胞、嗜酸粒細胞和嗜堿粒細胞的浸潤，深部固有層也可見嗜酸粒細胞的積累[18]。隨著時間的推移，可出現(xiàn)網(wǎng)狀基膜的輕微增厚，較哮喘的下呼吸道黏膜輕微，病變范圍也較局限。

卵清白蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs治療可使小鼠從大多數(shù)過敏性的病理改變中獲得保護，包括抑制炎性細胞浸潤和肺部黏液生成，減少鼻內(nèi)嗜酸粒細胞浸潤，減少支氣管肺泡和鼻腔灌洗液中的炎性細胞浸潤[19-22]。MSCs治療后AR小鼠血清中Th2細胞分泌IgE以及細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平均明顯降低。Li等[23]在AR大鼠實驗中觀察到，與對照組相比，MSCs除可抑制鼻腔黏膜中的組胺表達和巨噬細胞聚集外，還能顯著降低大鼠血清中IL-4、腫瘤壞死因子、IgE等的水平。為了進一步驗證MSCs在AR患者中的作用，F(xiàn)u等[24]提取AR患者外周血單核細胞，將其與不同細胞來源的MSCs進行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，各類MSCs不僅能抑制外周血單核細胞、淋巴細胞增殖，還能阻滯G1期T淋巴細胞的分化，從而抑制T淋巴細胞的成熟；進一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞反應(yīng)抑制T細胞表型向Th2細胞轉(zhuǎn)化，顯著降低Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生，表明MSCs的管理可抑制Th2免疫反應(yīng)，減少鼻腔及氣道黏膜炎性細胞浸潤，有效降低AR的過敏癥狀和炎癥反應(yīng)參數(shù)，可作為AR的臨床治療方法，用于治療過敏性氣道疾病。

5.2哮喘 哮喘是一種慢性炎癥性下呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為可逆的氣流阻滯、氣道高反應(yīng)性和間歇性呼吸反應(yīng)性癥狀，包括喘息、咳嗽、呼吸困難和胸悶。哮喘患者氣管支氣管樹發(fā)生的炎癥和結(jié)構(gòu)改變稱為重塑。目前，普遍認為慢性嗜酸粒細胞性炎癥是重塑發(fā)生的先決條件[25]。氣道分泌物異常會導(dǎo)致哮喘的病理過程，尤其是嚴重的、危及生命的惡化。少數(shù)病例的死亡被認為是氣道內(nèi)頑固黏稠的黏液與炎癥性嗜酸粒細胞滲出物混合導(dǎo)致的窒息所致。

MSCs在治療哮喘及并發(fā)癥方面具有重要作用。Li等[26]通過MSCs治療大鼠哮喘模型進行研究發(fā)現(xiàn)，移植MSCs的大鼠淋巴、外周血和肺組織標本中IL-10、叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)性T細胞水平均顯著升高；與對照組相比，移植MSCs大鼠肺組織中叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)水平有所增加，而IL-17、維甲酸孤兒核受體家族γt和Th17減少，炎性細胞浸潤也減少。近年來，關(guān)于MSCs治療小鼠哮喘模型的研究較多，通過溴脫氧尿苷標記BM-MSCs對卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型進行治療發(fā)現(xiàn)，哮喘組較對照組的組織病理學(xué)改變更加明顯；白細胞計數(shù)及嗜酸粒細胞的比例亦明顯升高；在接受BM-MSCs治療的小鼠肺中可見大量含溴脫氧尿苷的BM-MSCs沉積，BM-MSCs治療可顯著降低氣道病理指標、炎性細胞浸潤以及杯狀細胞增生[27-29]。Han等[30]用帶有促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs，成功構(gòu)建EPO-MSCs并用于治療發(fā)現(xiàn)，EPO-MSCs對哮喘局部氣道炎癥及肺組織IL-4、IL-5、IL-13水平的抑制作用強于MSCs；與哮喘組相比，治療組巨噬細胞的數(shù)量、平滑肌層厚度、膠原密度、增殖細胞核抗原陽性間充質(zhì)細胞和血管性血友病因子陽性血管的數(shù)量均明顯受到EPO-MSCs的抑制，且EPO-MSCs還下調(diào)了肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達，并活化轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1和p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)的信使RNA(message RNA，mRNA)和蛋白水平。以上研究表明，MSCs能調(diào)節(jié)Th17/調(diào)節(jié)性T細胞平衡，減少炎性因子生成，有效降低呼吸道炎性細胞浸潤，達到改善氣道高反應(yīng)性和調(diào)節(jié)氣道重構(gòu)的目的，且EPO-MSCs可更有效地減弱哮喘氣道重塑。

為進一步深入探討MSCs治療哮喘的機制，Tang等[31]采用微RNA(microRNA，miRNA)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)陣列分析MSCs治療前后哮喘小鼠體內(nèi)RNA的改變發(fā)現(xiàn)，共有296個miRNA在誘導(dǎo)哮喘和BM-MSCs治療后表達不同，其中14個miRNA在哮喘誘導(dǎo)和BM-MSCs移植之間呈現(xiàn)反向變異趨勢，通過增加樣本進一步證實了mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-449c-5p和mmu-miR-496a-3p在實時定量PCR表達不同；同時發(fā)現(xiàn)了19個與誘導(dǎo)過敏和BM-MSCs治療有關(guān)的基因，目標基因的分析顯示，mmu-miR-21a-3p與免疫調(diào)節(jié)劑活化素受體2A(activin receptor type 2A，Acvr2a)顯著相關(guān)，且在哮喘和BM-MSCs治療后與Acvr2a相關(guān)抗體表達相反；雙熒光素酶試驗報告也顯示，mmu-miR-21a-3p對Acvr2a的轉(zhuǎn)錄呈負性調(diào)控；此外，has-miR-21a抑制劑顯著增加了脂多糖刺激下人正常肺上皮細胞Acvr2a的mRNA表達。在此之后，Lin等[32]通過mRNA PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn)了47個蛋白編碼mRNA表達差異，分級聚類分析證實包括趨化因子配體11、嗜酸粒細胞趨化蛋白2、IL-13、IL-33和嗜酸粒細胞相關(guān)的核糖核酸酶A家族成員11等5個mRNA在哮喘模型誘導(dǎo)后顯著上調(diào)，經(jīng)MSCs處理下調(diào)。哮喘誘導(dǎo)和MSCs治療后有不同miRNA和mRNA的表達，而這些RNA是變態(tài)反應(yīng)和MSCs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的潛在靶點。

5.3COPD COPD是臨床常見的慢性呼吸道疾病之一。吸煙是目前公認的最重要的病因，但近年研究結(jié)果顯示，氣道高反應(yīng)性與循環(huán)中免疫細胞的改變與該疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[33-34]。臨床研究也觀察到，與正常人群相比，部分COPD患者血清中嗜酸粒細胞和中性粒細胞比例往往呈升高趨勢，且升高程度與疾病的預(yù)后呈負相關(guān)[35-36]?？梢?，過敏性炎癥反應(yīng)與COPD存在潛在相關(guān)性。

大量動物模型顯示了MSCs在COPD動物模型中的保護和修復(fù)作用。通過香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫模型研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈MSCs移植可阻斷肺氣腫的進展，降低細胞凋亡，調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激[37]。而Gu等[38]實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過下調(diào)COX-2和COX-2介導(dǎo)的PGE2生成可減輕氣道炎癥和肺氣腫，之后通過體外共培養(yǎng)實驗證明，抑制p38 MAPK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化及相關(guān)磷酸化可下調(diào)巨噬細胞COX-2/PGE2的分泌。Song等[39]的研究顯示，經(jīng)過MSCs治療的模型大鼠支氣管灌洗液中中性粒細胞和淋巴細胞的百分比較未經(jīng)處理組(對照組)明顯降低，且支氣管周圍及肺泡結(jié)構(gòu)的感染細胞浸潤較少。對COPD模型小鼠治療前后進行基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，長期暴露于香煙煙霧的小鼠經(jīng)過MSCs系統(tǒng)注射后，具有氧轉(zhuǎn)運和抗氧化功能的基因Hbb及Hba增加，血清蛋白酶抑制劑在相應(yīng)的時間點也有所增加[40]?？梢姡琈SCs一方面可通過抑制肺泡巨噬細胞中的COX-2/PGE2或p38 MAPK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路，減輕COPD動物模型中的氣道炎癥；另一方面，也可通過降低中性粒細胞及嗜酸粒細胞水平，減少機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻斷肺氣腫的進展，進而恢復(fù)部分受損的肺功能。

臨床前的體內(nèi)外研究都證明了MSCs可有效治療COPD。為進一步驗證MSCs治療的安全性及有效性，De Oliveira等[41]進行MSCs聯(lián)合單向支氣管內(nèi)瓣膜置入術(shù)(one-way endobronchial valves，EBV)治療肺氣腫Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，EBV+MSC聯(lián)合治療并沒有導(dǎo)致急性給藥相關(guān)毒性、嚴重不良事件或死亡的發(fā)生；兩組所有不良事件、COPD加重的頻率或疾病惡化的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；此外，患者在血液檢查、肺功能或放射學(xué)結(jié)果上也無統(tǒng)計學(xué)意義；且與EBV治療相比，EBV+MSC治療的生活質(zhì)量指標更高，在30～90 d內(nèi),患者的循環(huán)C反應(yīng)蛋白水平下降，BODE(B：體質(zhì)指數(shù)，O：氣道阻塞，D：呼吸困難，E：運動指數(shù))和改良版英國醫(yī)學(xué)研究委員會呼吸困難問卷評分下降，說明MSCs治療是安全的，MSCs管理能夠減少系統(tǒng)炎癥和COPD預(yù)測因子，并在治療后改善患者的生活質(zhì)量。

6 小 結(jié)

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和空氣污染的加重，呼吸系統(tǒng)疾病問題越來越突出，尋找更有效的治療迫在眉睫。MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能給呼吸系統(tǒng)相關(guān)變應(yīng)性疾病的治療帶來了希望，為這類疾病的治療提供了新的策略。目前大量研究表明,MSCs在治療呼吸道變應(yīng)性疾病上有較好的作用，但絕大部分集中在動物實驗方面，MSCs的給藥劑量、治療頻率以及潛在的作用機制仍有待進一步闡明[42]。此外，關(guān)于現(xiàn)實中MSCs治療的應(yīng)用還需要進行創(chuàng)新和改進，如制訂合適、嚴格的MSCs基礎(chǔ)治療規(guī)范和標準，以成為未來患者更有效、更安全的治療選擇[43]。