潘洲佳，顧佳楠，謝竹青,2，張 尹,2，屠穎歆，王 虎，陳培清，辛?xí)悦鳌?/p>

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，上海 201318； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201318)

腦血管疾病嚴(yán)重危害人類身體健康，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和長期殘疾的第三大原因，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中占80%～90%[1-2]。腦卒中的高發(fā)生率、高致殘率和高死亡率給社會及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。為了有效地篩選治療藥物，提高缺血性腦卒中的治愈率和恢復(fù)率，制作出接近人類腦梗死的理想大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型是腦科學(xué)工作者一直關(guān)注的課題，建立穩(wěn)定的動物模型是研究該類疾病最主要的手段之一?，F(xiàn)分別從實(shí)驗(yàn)動物和栓線材料的選擇、制作和栓線頭端的處理以及制作腦相關(guān)手術(shù)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響等方面對腦缺血模型制作方法的研究進(jìn)展予以綜述，以期建立穩(wěn)定可靠的MCAO再灌注模型，并提高制備模型的成功率和可行性。

1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇

1.1動物種類 選擇適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ褪菍?shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。MCAO高度模擬了臨床人類腦血管疾病的發(fā)病病理過程，結(jié)合臨床病理特點(diǎn)，建立符合人類疾病特點(diǎn)的動物模型對臨床上腦缺血發(fā)病機(jī)制及藥物篩選的研究具有重要意義。常用于制備腦缺血模型研究的動物有狒狒、猴、兔、犬和鼠等，每種動物都有其優(yōu)缺點(diǎn)，狒狒和猴的高級神經(jīng)中樞與人類非常相近，但費(fèi)用高、飼養(yǎng)難；犬的腦血管與人類差異較大，頸內(nèi)外動脈間吻合網(wǎng)豐富，若只阻斷單根顱內(nèi)動脈很難形成穩(wěn)定的病灶；兔的大腦皮質(zhì)不夠發(fā)達(dá)，研究效果不理想[3]。鼠類的飼養(yǎng)成本低且繁殖快，是目前最常用的實(shí)驗(yàn)研究動物。目前，大鼠是心腦血管疾病研究最常使用的實(shí)驗(yàn)動物之一，其食性與人類相近，且腦組織病變特點(diǎn)與臨床患者類似，用大鼠建立的MCAO再灌注模型的實(shí)驗(yàn)效果最佳。

1.2動物體型 不同體型大鼠制備模型的成功率不同。楊贊章和陳虹[4]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動物體重越小，死亡率越高，體重180 g以下大鼠的死亡率高達(dá)70%，而體重350 g以上大鼠的死亡率低于10%，但體重350 g以上大鼠的體重過大、血管較粗，導(dǎo)致模型制備的成功率降低，因此，需要選擇體重適宜的大鼠制備模型。此外，大鼠的生命力較強(qiáng)，抗感染能力強(qiáng)，易存活，大鼠的體重為250～300 g時模型的成功率較為理想[5]。

2 栓線材料的選擇及制作

2.1栓線材料的選擇 選擇合適的線栓是模型成功的關(guān)鍵，線栓要軟硬適度。為了減少動物損傷，提高成模率，實(shí)驗(yàn)用栓線也在不斷改善。栓線種類有尼龍線、鼠須、釣魚線等，常規(guī)MCAO模型所用栓線材料為尼龍線[6]。甘雨等[7]選用尼龍線制備MCAO模型的研究發(fā)現(xiàn)，尼龍線直徑均一，弧度及硬度適中，不僅大幅度提高了模型制備的成功率，還節(jié)約了栓線的制作時間。但謝寧等[8]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尼龍線硬度不夠、韌性不高，易在彎曲血管處停留，且在一定溫度時易變軟，使其入顱比較困難，由于進(jìn)線深度不夠常導(dǎo)致腦缺血模型的制作失敗。隨后，Wang等[9]的實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論。曹霞和丙秉振[10]發(fā)現(xiàn)，鼠須具有良好的硬度和彈性，內(nèi)在性質(zhì)均一，使用鼠須代替尼龍線可以克服尼龍線韌性較差的缺陷，可顯著提高M(jìn)CAO模型制備的成功率；但鼠須直徑不一，頭端難以處理，無法完全阻塞血管。Tang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，釣魚線內(nèi)在性質(zhì)均一，硬度及彈性良好，頭端易處理，可作為良好的栓線材料。近年來，研究者大多使用釣魚線作為栓線的首選材料。

2.2栓線制備 目前常用的栓線頭端處理方法有Longa法、Koizmi法和石蠟法3種。Longa法是將栓線的頭端燒成球形，目前大部分研究采用此方法制備栓線頭端[12]。但Laing等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，采用Longa法栓線操作時插線困難，易穿破血管，再灌注后易引發(fā)動脈血管破裂出血，導(dǎo)致再灌注成功率較低。在上述研究的基礎(chǔ)上，Reglodi等[14]對Longa法進(jìn)行改進(jìn)，將栓線頭端燒成小圓頭，制成頭端大小一致、鈍圓光滑的栓線，將栓線的頭端浸入0.1%的多聚賴氨酸溶液，浸泡完全后置于60 ℃的烤箱中烘干備用，用其制備MCAO模型的成功率達(dá)到100%。

Koizmi法是在栓線的頭端涂抹硅酮，多項(xiàng)研究均采用此方法制備栓線[15-17]。Belayer等[16]將栓線頭端加熱后使其頭端變圓鈍，然后將多聚賴氨酸溶液涂于距栓線頭端20 mm處，發(fā)現(xiàn)涂抹多聚賴氨酸溶液的線栓制備MCAO模型的成功率提高，大鼠的死亡率下降。而李振宗等[17]將多聚賴氨酸和硅酮處理的栓線對模型的影響進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，硅酮處理的線栓模型的成功率、穩(wěn)定性和重復(fù)性均優(yōu)于多聚賴氨酸處理的模型。

石蠟法是使用加熱熔化的固體石蠟處理栓線取代Koizmi涂硅酮的方法，在距栓線插入端5 mm內(nèi)均勻涂抹石蠟，簡便省時，保證了良好的栓塞效果。王耀明等[18]亦有石蠟法栓塞效果的報道。Zuo等[19]對石蠟處理栓線的MCAO模型研究發(fā)現(xiàn)，其模型制備的成功率達(dá)到了100%，將固體石蠟經(jīng)加熱熔化后處理的栓線的均一性良好，石蠟與栓線緊密黏附，插線后導(dǎo)致的腦梗死體積比其他栓線插線后形成的腦梗死體積更大，死亡率更低。石蠟的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，不與血液中的成分發(fā)生反應(yīng)，且經(jīng)石蠟處理的栓線粗細(xì)適中、頭端光滑圓鈍，對血管壁無刺激，不易對血管壁造成直接損傷。

2.3栓線長度和直徑的選擇 穩(wěn)定可靠MCAO模型的建立，不僅需要選擇合適的大鼠，還需要符合其他相應(yīng)的條件。Kuge等[20]對MCAO模型制作的研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的體重與所使用的栓線長度成正比，可根據(jù)大鼠體重選擇栓線的長度。

此外，不同品牌外科手術(shù)縫線的直徑不同，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)所建立的模型選擇不同的栓線長度和直徑。李忠仁和崔龍[21]認(rèn)為，插線需要根據(jù)不同大鼠的TC線 (動物門齒根部T點(diǎn)與頸總動脈分叉點(diǎn)C點(diǎn)的距離)選擇適宜的插入深度，兩者存在密切關(guān)系，但未報道其線長、線直徑與模型制備效果的關(guān)系。辛世萌等[22]對大鼠體重確定的模型制備結(jié)果評分進(jìn)行方差分析證實(shí)，栓線直徑對模型制備有明顯影響，并發(fā)現(xiàn)栓線直徑為0.28 mm時，阻塞效果好；對腦梗死體積進(jìn)行方差分析顯示，栓線直徑對模型制備的影響無差異，由此可見，直徑為0.28 mm、長17～18 mm栓線的重復(fù)性良好，對動物生理指標(biāo)的影響小，成功率高。

3 實(shí)驗(yàn)操作的改進(jìn)

3.1左右側(cè)動脈選擇 模型制備過程中，手術(shù)動脈的選擇也具有決定性作用。高煥民等[23]對MCAO再灌注模型中左側(cè)與右側(cè)大腦動脈栓塞差異的研究顯示，左側(cè)再灌注24 h、48 h及72 h后神經(jīng)功能缺損評分顯著低于右側(cè)；左側(cè)缺血程度較右側(cè)重；左側(cè)神經(jīng)元數(shù)量缺失嚴(yán)重，海馬細(xì)胞排列十分紊亂，腦梗死體積明顯大于右側(cè)，由此可見，模型制備時選擇右側(cè)動脈栓塞的成功率較高，且較安全可靠。陳春富和李勁松[24]認(rèn)為，頸部手術(shù)可能對左側(cè)大腦迷走神經(jīng)造成損傷，對心臟、血壓產(chǎn)生較大影響。實(shí)際手術(shù)操作中要盡量避免損傷大鼠的頸部周圍組織，其中迷走神經(jīng)尤為重要，一旦刺激迷走神經(jīng)，極易引起大鼠呼吸暫停和心臟停搏。張傳灼等[25]的研究證實(shí)，左側(cè)動脈栓塞可能損傷迷走神經(jīng)，易引起嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷，因此，為減少大腦外在因素的影響，應(yīng)盡量選擇右側(cè)動脈。選擇右側(cè)動脈栓塞有助于體溫和血壓的平穩(wěn)。何芳雁等[26]的實(shí)驗(yàn)研究表明，選擇右側(cè)動脈避免刺激左側(cè)迷走神經(jīng)，有利于提高大鼠的成活率及模型制備的成功率。

3.2手術(shù)切口位置 目前，大鼠MCAO頸部手術(shù)切口有頸部正中切口和頸部外側(cè)切口兩種[27]。絕大多數(shù)研究者采用大鼠頸部正中切口，首先將大鼠以仰臥位固定于操作臺上，頸前區(qū)消毒，切開時依次經(jīng)過頜下腺、下頜淋巴結(jié)、胸鎖乳突肌、胸骨舌骨肌等，鈍性分離肌肉及筋膜，充分暴露右側(cè)頸總動脈[5]。頸內(nèi)動脈分支的翼腭突動脈較粗，且走行與頸內(nèi)動脈一致，多數(shù)情況下插線易插入分支翼腭突動脈而不能入顱，故可暴露翼腭突動脈而不結(jié)扎，讓栓線越過翼腭突動脈插入顱內(nèi)，保證充分地再灌注。手術(shù)中需分離和保護(hù)氣管、迷走神經(jīng)和舌咽神經(jīng)叢等，此操作易傷及左側(cè)迷走神經(jīng)，對心臟造成影響，手術(shù)風(fēng)險和難度較高，對操作者的要求較高[28]。陳春富和李勁松[24]選用的頸部外側(cè)切口，手術(shù)視野好，血管和肌肉易于分離，氣道分泌物產(chǎn)生少，不需要輔助呼吸，且對器官的刺激性小，手術(shù)較簡單，成功率較高。胡華等[29]采取頸部外側(cè)切法的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，操作中適當(dāng)調(diào)整血管和線栓的進(jìn)入角度，可提高模型制備的成功率?？梢?，頸部外側(cè)切口可降低手術(shù)難度和動物死亡率；手術(shù)視野暴露較充分，對氣管刺激小，出血量較少，對大鼠損傷小，有利于實(shí)驗(yàn)動物存活。

3.3栓線插入位置 栓線插入位置的選擇對模型制備的成功也有很大影響。目前，栓線的插入方法主要有兩種，一種是采用頸外動脈切口位置插入栓線的傳統(tǒng)方法，將合適的栓線從頸外動脈緩慢插入，后向下輕按頸外動脈，使栓線成直線插入頸內(nèi)動脈，以便栓線沿頸外動脈經(jīng)過頸總動脈分叉處入頸內(nèi)動脈，到大腦前動脈，后至大腦中動脈[30]。栓線插入需緩慢送入頸內(nèi)動脈，遇有輕微阻力停止，之后可將外留的多余栓線涂黑，殘端盡量保留長一些，以便再灌注時拔線。甘雨等[7]研究發(fā)現(xiàn)，線栓插入深度一般為(18.0±0.5) mm，并可術(shù)前標(biāo)記栓線18 mm 位置，若進(jìn)線遇到阻力時，進(jìn)線長度已達(dá)18 mm，應(yīng)立即停止進(jìn)線，以免造成蛛網(wǎng)膜下腔出血；若不到 18 mm，則可緩慢退出2～3 mm，重新調(diào)整角度再緩慢送入頸內(nèi)動脈。陳嵐等[30]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從頸外動脈插入栓線可以保留頸總動脈的完整性，且由于栓線與頸內(nèi)動脈近似成直線，為頸外動脈再灌注的血流通暢提供了條件，可實(shí)現(xiàn)充分復(fù)灌。王新鳳等[31]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從頸外動脈插入的栓線繞過頸總動脈和頸內(nèi)和頸外血管形成的分叉，再進(jìn)入頸內(nèi)動脈時更易進(jìn)入大鼠大腦中動脈。但栓線進(jìn)入頸內(nèi)動脈的實(shí)驗(yàn)操作要求較高，由于頸外動脈較細(xì)，插入過程中易被扯斷或剪斷而不能有效控制出血量，且對動物損傷大，故操作難度較大。

另一種方法是栓線從頸總動脈經(jīng)頸內(nèi)動脈直接插至大腦中動脈的起始部，再灌注時抽回栓線至頸總動脈內(nèi)，此方法操作較簡單，優(yōu)點(diǎn)是可不分離頸內(nèi)動脈、迷走神經(jīng)等，對血管的刺激較小，避免了迷走神經(jīng)受損而影響心臟的可能性等，對生理結(jié)構(gòu)的損傷也較小，可形成穩(wěn)定的梗死灶。但由于頸總動脈的結(jié)扎，需通過前后交通動脈實(shí)現(xiàn)再灌注，由于再灌注血流是非正常生理性流向，因此難以保證大鼠的正常血供，且反復(fù)插入易加重血管損傷，增加死亡率。因此，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求選擇適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄖ谱髂X缺血再灌注模型。

4 手術(shù)注意事項(xiàng)

大腦對缺血再灌注損傷的耐受程度與術(shù)前體內(nèi)葡萄糖濃度密切相關(guān)，故術(shù)前大鼠應(yīng)自由進(jìn)食，以確保大鼠體內(nèi)的葡萄糖濃度。若術(shù)后大鼠情況欠佳，可補(bǔ)充1%葡萄糖溶液，以提高大鼠的耐受力，縮短蘇醒時間，提高成功率。

手術(shù)時，手術(shù)室溫度需要保持在28 ℃左右，手術(shù)臺可以用烤燈(距離60 cm高度)持續(xù)照射保溫，防止手術(shù)過程中大鼠因亞低溫而受損。在整個手術(shù)過程中，要實(shí)時監(jiān)測大鼠的直腸溫度，并保持循環(huán)加熱墊的溫度以保證大鼠37 ℃的體溫，盡量保持手術(shù)過程中大鼠生命體征的穩(wěn)定[32]。此外，圍術(shù)期的護(hù)理也很重要，術(shù)后48 h內(nèi)動物的死亡率最高，若安全度過危險期則存活率明顯提高，故需實(shí)時監(jiān)測大鼠體溫，保證良好的生命體征。

5 小 結(jié)

隨著MCAO模型制備方法的不斷改進(jìn)和發(fā)展，對MCAO模型的動物選擇、模型制備等也不斷改善，MCAO模型制備的成功率明顯提高，術(shù)后損傷逐漸減少，使腦MCAO模型日趨成熟和完善。目前，線栓法是公認(rèn)的較為理想的制備MCAO模型的方法，主要用于臨床腦血管疾病的研究，但手術(shù)操作要求高、模型差異性大、動物死亡率高，仍需進(jìn)一步的研究以明確各因素對模型制備的實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟等的影響，嚴(yán)格注重細(xì)節(jié)，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)對模型進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，為腦缺血臨床治療的研究提供更優(yōu)質(zhì)的動物模型。