馮 丹，霍 炎

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 200233)

近年來，哮喘的發(fā)病率明顯升高，長期遷延不愈可導致肺氣腫、肺源性心臟病等嚴重疾病。哮喘是臨床常見的慢性氣道炎癥疾病，以氣道高反應性和氣道重構為主要特征，其中慢性炎癥所致的氣道重構是導致不可逆性氣道阻塞以及氣道高反應性持續(xù)惡化的重要病理改變。哮喘氣道重構的因素眾多，包括多種免疫細胞浸潤、上皮損傷、纖毛功能障礙、杯狀細胞增生、網狀層和網狀基膜厚度增加、血管分布增加、上皮下纖維化以及纖維細胞和氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的增生肥大[1-2]。由ASMCs構成的氣道平滑肌是構成氣道壁的重要結構，參與氣道重構的發(fā)生與發(fā)展，而氣道平滑肌增厚亦是哮喘氣道重構的重要特征。正常人體ASMCs多為收縮表型(正常表型)，維持氣道的正常功能，而哮喘患者的ASMCs在多種因素刺激下可發(fā)生表型改變，主要表現(xiàn)為過度增殖等導致的氣道重構，造成哮喘患者氣道狹窄和氣道高反應性的進一步惡化[3]。因此，防止和減輕氣道重構是哮喘防治的重要策略。ASMCs是氣道重構的重要特征，現(xiàn)就影響ASMCs增殖的因素及其相關信號通路予以綜述，以進一步了解ASMCs增殖在氣道重構中的作用。

1 氣道結構及ASMCs細胞學基礎

氣道結構從內到外依次是黏液細胞、上皮、上皮下區(qū)域、成纖維細胞、氣道平滑肌層及外膜，在較大氣道中還包含軟骨。隨著氣道分支的增多，軟骨占氣道組織的比例逐漸減少，而平滑肌占氣道組織的比例逐漸增多，約占小氣道(內徑<2 mm)組織的100%[4]。

正常人體氣道的ASMCs為收縮表型，主要通過收縮和舒張氣道來調控氣流。ASMCs是α-平滑肌肌動蛋白陽性細胞，表達各種收縮蛋白，其中主要的收縮蛋白包括平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶、肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和其他蛋白，如轉膠蛋白、CD38、組胺H1受體和其他無關收縮蛋白質。平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶是一種Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶，是調節(jié)ASMCs收縮的主要酶類。刺激平滑肌細胞后，Ca2+由細胞外液進入胞內或通過1,4,5-三磷酸肌醇的作用從細胞內儲庫中釋放，使細胞內液Ca2+瞬時升高，隨后，Ca2+/鈣調蛋白復合物激活平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶，磷酸化20 kD肌球蛋白調節(jié)輕鏈，導致肌球蛋白ATP酶激活，并引發(fā)收縮[5-6]。α-平滑肌肌動蛋白是最重要的肌動蛋白，通常作為成熟的、可收縮的平滑肌細胞標志，用來鑒別平滑肌細胞[7]。當ASMCs發(fā)生增殖時，α-平滑肌肌動蛋白和CD38的表達水平升高，細胞內鈣信號發(fā)生變化，收縮蛋白平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶和肌球蛋白重鏈也發(fā)生相應變化，氣道收縮性發(fā)生改變[8-13]。

此外，ASMCs也是影響氣道重構的主要因素。ASMCs過度增殖可導致氣道平滑肌層增厚，占據(jù)氣道更大空間；還可分泌炎癥因子進一步參與氣道重構。哮喘的嚴重程度也與氣道壁內ASMCs的數(shù)量相關[14]。氣道平滑肌層增厚為確定哮喘的標志，在致命性哮喘或嚴重哮喘中尤為明顯。在無任何刺激因素時，哮喘患者ASMCs的體外增殖速度遠遠超過非哮喘患者，與非哮喘患者正常氣道平滑肌層厚度相比，致命哮喘患者氣道平滑肌層厚度增加50%～200%，而非致命哮喘患者增加25%～55%[15]。

2 影響ASMCs增殖的因素

ASMCs過度增殖是哮喘氣道重構的最顯著特點，可使氣道收縮能力增加，氣道壁增厚，導致嚴重的氣流受限及氣道高反應性。了解影響ASMCs增殖的因素對哮喘的防治至關重要。研究表明，體內外大量的促有絲分裂因子可促進ASMCs增殖，包括生長因子、細胞因子與炎癥介質、酶與細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)、微RNA(microRNA，miRNA)及其他因素等。

2.1生長因子/炎癥介質/細胞因子 血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)-BB通過激活胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、 p38和c-Jun氨基端激酶通路以及促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路，上調Wnt/β聯(lián)蛋白信號轉導通路，增加細胞周期蛋白D1的表達等多種信號通路，促進ASMCs增殖[16-19]。體外研究表明，轉化生長因子-β1以濃度和時間依賴方式促進ASMCs增殖，與正常大鼠相比，哮喘大鼠的ASMCs會分泌更多的轉化生長因子-β1，轉化生長因子-β1又進一步誘導哮喘大鼠ASMCs的增殖[20-22]。血管內皮生長因子也在哮喘氣道重構的過程中起重要作用。有研究表明，血管內皮生長因子可通過促進解整合素金屬蛋白酶33的表達，增強ASMCs的增殖[23]。此外，腦源性神經營養(yǎng)因子以及一系列炎癥刺激因子也可誘導ASMCs的增殖，包括經典的Th1型和Th2型細胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-4、白細胞介素-13和白細胞介素-5)以及胸腺基質淋巴細胞生成素、白細胞介素-6和Th17家族細胞因子等[24-25]。

另有研究顯示，ASMCs還可通過分泌一些炎癥因子(如細胞黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1和CXC趨化因子配體10等)招募肥大細胞和T細胞進入氣道平滑肌層，進而促進ASMCs增殖，參與氣道重構[26]。有研究表明，哮喘患者氣道平滑肌束中肥大細胞浸潤程度明顯高于嗜酸粒細胞性支氣管炎患者及正常人群[27]。哮喘患者的ASMCs大量分泌CXC趨化因子配體10，其可與肥大細胞中趨化因子受體3結合，從而定向驅使肥大細胞進入氣道，隨后肥大細胞脫顆粒，分泌類胰蛋白酶、白三烯和前列腺素，進一步促進ECM沉積，并激活ASMCs的增殖[26,28-29]。哮喘的嚴重程度與ASMCs增殖以及T細胞浸潤明顯相關，T細胞通過血管細胞黏附分子-1附著于ASMCs上，并與ASMCs直接接觸促進ASMCs增殖[30]。

2.2酶和ECM 類胰蛋白酶是絲氨酸家族蛋白酶類，在肥大細胞和嗜堿粒細胞中選擇性表達。體外研究表明，類胰蛋白酶是犬ASMCs的促生長因子，可以濃度依賴性方式促進人ASMCs中DNA的合成。另有研究表明，高濃度類胰蛋白酶促進ASMCs增殖的效應高于凝血級聯(lián)蛋白酶及其他肥大細胞蛋白酶類(如凝血酶、凝血酶因子Xa和糜蛋白酶等)所誘導的ASMCs增殖效應[29,31]。肥大細胞產生的類胰蛋白酶可激活ASMCs中蛋白酶激活受體-2的表達，哮喘患者ASMCs中蛋白酶激活受體-2表達水平的升高，進一步促進了ASMCs的增殖[32]。ASMCs還生成非活性基質金屬蛋白酶-1，可被激活的肥大細胞類胰蛋白酶水解而活化，從而促進ECM沉積，使ASMCs生長速率增加約1.5倍。哮喘患者氣道中的非活性基質金屬蛋白酶-1較無肺疾病人群高5.4倍，且活性基質金屬蛋白酶-1的數(shù)量與哮喘惡化程度密切相關[33]。

ECM由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、彈性蛋白和細胞黏合素等大分子組成，形成復雜的動態(tài)網絡，其中膠原蛋白可明顯促進ASMCs增殖，增加S期細胞的數(shù)量，提高ASMCs的遷移和黏附能力[34]。基質力學的改變也可使ASMCs的增殖發(fā)生變化，在具有受控彈性模量的膠原綴合的聚丙烯酰胺水凝膠上培養(yǎng)ASMCs發(fā)現(xiàn)，若培養(yǎng)凝膠較平均氣道組織硬度低，則可顯著增加ASMCs中血管內皮生長因子的分泌；若培養(yǎng)凝膠較平均氣道組織硬度高，則能促進細胞增殖，同時減少血管內皮生長因子分泌和激動劑誘導的鈣反應[35]。

2.3miRNA miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與目標信使RNA分子結合，促進信使RNA降解，參與轉錄后基因的表達調控。有研究證明，miRNA既參與調控ASMCs的炎癥反應，又可調控ASMCs的收縮功能，還能調控ASMCs的生長與增殖[36]。體外研究證明，經胎牛血清和轉化生長因子刺激后，嚴重哮喘患者ASMCs的miR-221表達水平明顯上調，通過miR-221模擬物上調miR-221水平，促進ASMCs增殖；其抑制劑下調miR-221水平，抑制嚴重哮喘患者ASMCs的過度增殖[22]。

體外研究表明，miR-590-5p能調控多種細胞的增殖，過表達miR-590-5p可抑制ASMCs增殖[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a是人原代ASMCs中表達最豐富的miRNA，占所有小RNA分子總量的20%，miR-10a的過度表達可以減少絲裂原誘導的人ASMCs增殖，抑制miR-10a的表達則可明顯增加ASMCs增殖[36]。miR-203可負性調控ASMCs增殖，過表達miR-203抑制PDGF誘導的細胞增殖，減少哮喘患者ASMCs中miR-203的表達，抑制ASMCs的增殖[38]。

2.4其他 氣道長時間暴露于香煙煙霧中會誘發(fā)氣道重構并導致哮喘惡化。小鼠長時間暴露于香煙煙霧可造成氣道平滑肌層增厚并纖維化，且香煙提取物能促進ASMCs增殖，減少ASMCs凋亡，增加ECM沉積，這種現(xiàn)象可能與線粒體形態(tài)(分裂/融合平衡)和功能的改變以及MAPK通路相關[39-41]。有研究報道，香煙煙霧的主要致癮成分尼古丁在體外呈時間依賴性地誘導大鼠ASMCs的DNA合成，增加ASMCs數(shù)量，并通過蛋白激酶B通路誘導細胞周期蛋白D1的表達[42]。

約80%的兒童哮喘患者和超過50%的成人哮喘患者具有免疫球蛋白E依賴性，免疫球蛋白E可加重氣道重構，但具體分子機制尚不清楚。免疫球蛋白E致敏可延長炎癥細胞的存活時間并增加炎癥介質釋放，人源ASMCs同時表達低親和性Fc段受體Ⅱ/CD23和高親和性Fc段受體Ⅰ免疫球蛋白E受體，且免疫球蛋白E還可調節(jié)人源ASMCs的收縮和合成功能[43]。此外，有研究表明，免疫球蛋白E呈濃度依賴性地誘導人源ASMCs增殖，促進DNA合成，并增加ASMCs中ECM和膠原的沉積[44-45]。

長鏈非編碼RNAs可以通過與DNA、RNA和蛋白質的相互作用來發(fā)揮多種生物學活性。腦細胞質RNA1是有200個堿基的長鏈非編碼RNA，具有翻譯調節(jié)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的原代ASMCs中，腦細胞質RNA1的調節(jié)活性差異明顯，哮喘模型大鼠ASMCs中腦細胞質RNA1的表達水平明顯高于健康大鼠，上調腦細胞質RNA1的表達可顯著增強哮喘大鼠ASMCs的增殖和遷移；此外，還發(fā)現(xiàn)經PDGF-BB處理的ASMCs亦可表達更高水平的腦細胞質RNA1[46]。來自哮喘患者的嗜酸粒細胞與ASMCs共培養(yǎng)可增加ASMCs中Wnt5a、轉化生長因子-β1、膠原蛋白和纖連蛋白的表達，進而促進ASMCs的增殖[47]。

3 與ASMCs增殖相關的機制及信號通路

3.1Ca2+通道途徑 Ca2+作為細胞內重要的第二信使能調節(jié)多種細胞活動，如細胞收縮、分泌、代謝、增殖和分化等。正常細胞內外Ca2+呈動態(tài)平衡狀態(tài)，其穩(wěn)態(tài)是維持細胞正?；顒拥那疤?，Ca2+的運輸機制對維持細胞內外Ca2+穩(wěn)態(tài)至關重要。在穩(wěn)態(tài)條件下，細胞內Ca2+維持低濃度(100 nmol/L)，細胞外Ca2+維持高濃度(1 mmol/L)[48]。當細胞內Ca2+增加時，Ca2+穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，哮喘患者ASMCs發(fā)生增殖[49]。哮喘嚴重時，過多Ca2+進入細胞導致過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α、核呼吸因子-1和線粒體轉錄因子A的激活以及線粒體生物合成增加，造成ASMCs增殖。而哮喘患者內皮細胞和上皮細胞并不出現(xiàn)細胞異常增殖以及線粒體合成的增加，具有明顯的平滑肌細胞特異性[50]。細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)主要通過肌質網Ca2+ATP酶催化ATP水解并將細胞質中游離的Ca2+轉運到肌質網來實現(xiàn)。研究顯示，中重度哮喘患者ASMCs的肌質網Ca2+ATP酶2表達明顯降低；健康人群ASMCs敲減肌質網Ca2+ATP酶2后，ASMCs增殖明顯加快[51]。刺激ASMCs后，CD38激活，環(huán)腺苷二磷酸核糖觸發(fā)1,4,5-三磷酸肌醇或激活蘭尼堿受體引發(fā)Ca2+從肌質網釋放至細胞質，導致細胞內Ca2+濃度升高。香煙提取物呈濃度依賴地增加ASMCs內Ca2+相關蛋白色氨酸相關蛋白3、CD38、基質交感分子1等的表達，并與ASMCs的增殖密切相關[52]。Ca2+內流可以通過瞬時感受器香草酸受體電位通道4產生Ca2+微域，稱為“瞬時感受器香草酸受體電位通道4 Ca2+火花”。瞬時感受器香草酸受體電位通道4與ASMCs中的Ca2+/鈣調蛋白依賴性鈣調磷酸酶共定位，激活鈣調磷酸酶并使細胞質中活化T細胞核因子去磷酸化，以激活核轉位和合成轉錄途徑，從而誘導ASMCs增殖[53]。

瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員7是一種非選擇性陽離子通道，其C端具有獨特的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域，允許各種二價陽離子(如Ca2+、Mg2+)通過，在多數(shù)細胞的存活和增殖等生理過程中具有重要作用。與正常大鼠相比，暴露于煙霧中的大鼠的瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員7表達明顯升高，香煙提取物或腫瘤壞死因子-α可明顯增加來自煙霧暴露大鼠ASMCs的細胞數(shù)；但瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員7沉默可減少香煙提取物刺激的ASMCs增殖[54]。

3.2MAPK途徑 MAPK可以調節(jié)包括ASMCs增殖在內的多種細胞生理功能，對氣道重構起重要作用。ASMCs受到生長因子刺激后，RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶-1磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2可激活ERK1/2，繼而磷酸化多種下游蛋白激酶、轉錄因子和其他蛋白，共同促進ASMCs增殖。極樣激酶1是參與細胞周期相關過程的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。有研究表明，PDGF可上調人ASMCs中極樣激酶1的磷酸化水平，而敲除極樣激酶1后，PDGF所誘導的促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2和ERK1/2的磷酸化水平明顯降低，ASMCs增殖明顯下降[55]。血管內皮生長因子亦可通過促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2通路誘導ASMCs增殖，而維生素D3亦是通過抑制ERK1/2的磷酸化進程來抑制血管內皮生長因子誘導的增殖[23]。維生素D缺乏與哮喘嚴重程度密切相關[56]。維生素D主要通過抑制ERK1/2通路和下調解整合素金屬蛋白酶33和基質金屬蛋白酶-9的表達來抑制ASMCs的生長并對抗氣道重構[23,57-58]。另有研究發(fā)現(xiàn)，小分子褐藻糖膠通過抑制PDGF誘導的蛋白激酶B、ERK1/2和核因子κB的磷酸化來調控細胞的G1/G0周期，從而抑制ASMCs的增殖[59]。

3.3氧化應激途徑 細胞內活性氧類主要由線粒體產生?；钚匝躅愖鳛榈诙攀箙⑴c調節(jié)細胞內多種分子途徑，并可促進多種細胞的增殖，在ASMCs病理性增殖中具有重要作用[60]。許多因素可使ASMCs中活性氧類的含量升高，如香煙提取物可明顯促進ASMCs增殖，并可在ASMCs內檢測到高水平的活性氧類[52]。NADPH氧化酶4是人ASMCs 中主要的NADPH氧化酶，轉化生長因子-β1通過調控NADPH氧化酶4的表達提高細胞中活性氧類的水平，從而促進ASMCs的增殖，可見，轉化生長因子-β1誘導ASMCs增殖也與活性氧類密切相關[61]。此外，PDGF-BB對ASMCs增殖的作用也與活性氧類水平密切相關[62]。研究發(fā)現(xiàn)，S100鈣結合蛋白A9可明顯抑制ASMCs增殖，降低細胞內S100鈣結合蛋白A9的表達可顯著促進PDGF誘導的大鼠ASMCs增殖，并增加細胞內活性氧類水平[63]。

4 小 結

氣道重構是哮喘(尤其是中重度哮喘和致命性哮喘)的重要病理特征，可導致不可逆性氣道阻塞以及氣道高反應性的持續(xù)惡化。ASMCs是最基本的氣道結構細胞，可通過收縮或舒張氣道調節(jié)氣流。ASMCs作為氣道內的主要效應細胞，被誘導激活后發(fā)生過度增殖，在氣道重構中起重要作用，明確影響ASMCs增殖的因素及相關分子機制對哮喘的防治具有重要意義。對ASMCs研究的不斷深入以及調控ASMCs增殖新靶標的發(fā)現(xiàn)將為哮喘防治提供新的思路和研究方向。