侯 麗，喬春霞，王鸞鸞，孫令驍

（1. 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，山東 濟南 250101；2. 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，山東濟南 250101）

一次性使用血漿病毒滅活輸血器材是采用亞甲藍/光照病毒滅活法，對血漿中人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人類嗜T淋巴細胞病毒（HTLV）等脂質(zhì)包膜病毒進行滅活，以保證臨床輸血安全的醫(yī)療器械。目前此方法在國內(nèi)各個血站應用較為廣泛[1]。對于血漿病毒滅活輸血器材的研究，目前主要集中于對病毒滅活效果、滅活后血漿成分回收率[2-3]、是否產(chǎn)生輸血反應[4]等方面，沒有對亞甲藍經(jīng)光照后輸入人體后是否有潛在的毒理學風險進行研究。本文作者模擬血漿病毒滅活輸血器材在血站的實際使用過程，并對其遺傳毒性進行了研究，以評估此類產(chǎn)品的使用安全性。

1 材料與試劑

1.1 測試樣品

一次性使用血漿病毒滅活輸血器材（南京雙威醫(yī)學科技公司）。

1.2 試劑

敵克松，環(huán)磷酰胺，絲裂霉素，甲基磺酸甲酯，2-氨基蕪，三氟胸苷（分析純，Sigma）；RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone?）；新生牛血清（浙江天杭）；羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液（南京正大天晴，批號1208291）。

1.3 細胞株

CHL細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫；L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫。

1.4 菌株

鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102 菌株（上海寶錄生物科技公司），經(jīng)組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、R因子鑒定、紫外線缺陷型鑒定、四環(huán)素抗性鑒定，TA97，TA98，TA100，TA102符合試驗要求。

實驗前將菌株接種至肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩器上增菌培養(yǎng)14～16 h（37 ℃，120 r/min）。

1.5 代謝活化系統(tǒng)（S9混合液）

鼠肝微粒體酶混合物（S9勻漿，上海寶錄生物科技公司）。使用前添加其他輔助成分[0.4 mol/L MgCl20.2 ml，1.65 mol/L KCl 0.2 ml，0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸1.0 ml，0.025 mol/L NADP 1.6 ml，0.2 mol/L PBS（pH 7.4）6.0 ml]，將S9勻漿1 ml與以上輔助成分混合液混合配制成S9混合液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 樣品制備方法

按一次性使用血漿病毒滅活輸血器材產(chǎn)品使用說明中的操作方法將血漿病毒滅活輸血器材的血袋穿刺器刺入羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液中，使其通過亞甲藍釋放件全部充入光照袋至標稱容量，并使其混勻，經(jīng)市售醫(yī)用病毒滅活柜光照處理，光照處理后經(jīng)一次性使用血漿病毒滅活輸血器材的吸附濾器吸附過濾，制成供試液，受試物含殘留的亞甲藍及其降解產(chǎn)物。供試液制備后，放置-18 ℃保存待用。臨用前，將裝有供試液的血袋放置37±1 ℃，浸提72±2 h。羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液同法制備作為對照液。

2.2 細菌回復突變試驗（Ames試驗）

采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA 9 7、TA98、TA100和TA102 4種菌株進行試驗。設立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對照，敵克松（TA97菌株、TA98菌株、TA100菌株）、2-氨基芴（TA100菌株）、甲基磺酸甲酯（TA102菌株）為陽性對照，采用平板摻入法，各菌株分別在加S9與不加S9混合液的條件下進行試驗。在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入每種試驗菌株新鮮菌液0.1 ml，樣品組分別加供試液0.1 ml（活化組再加10 % S9混合液0.5 ml，無活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5 ml）；陰性對照組分別加相應的對照液0.1 ml，陽性對照組分別加相應的誘變劑0.1 ml，其余操作相同。每組3管，混勻后迅速將每管溶液分別傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h觀察結(jié)果。計數(shù)并記錄每一平皿的回變菌落數(shù)，并計算出3個平皿的平均值。將所用的4個測定品系的每一品系被測平板的回復突變平均數(shù)與其相應的陰性對照回復突變平均數(shù)作比較。

2.3 體外小鼠淋巴瘤細胞突變試驗

采用L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）細胞進行試驗。設立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對照，甲磺酸甲酯（MMS，無活化系統(tǒng)，10 μg/ml）、7, 12-二甲基苯蒽（DMBA，活化系統(tǒng)，2.5 μg/ml）作為陽性對照。在加S9與不加S9混合液的條件下進行試驗，首先調(diào)整L5178Y TK+/- 細胞濃度至2×105個細胞/ml，取10 ml細胞懸液與9 ml供試液或?qū)φ杖芤夯旌虾蠼佑|培養(yǎng)，最后加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3 μg/ml）培養(yǎng)。計數(shù)各平板無集落生長的孔數(shù)并計算PE0（第0天平板效率）和PE2（第2天平板效率）、RS（平板效率相對存活率）、MF（TFT抗性突變頻率）。

2.4 體外染色體畸變試驗

采用中國倉鼠肺細胞（CHL）進行試驗。設立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對照，絲裂霉素C（MMC，無活化系統(tǒng)，短期接觸0.4 μg/ml和持續(xù)接觸0.2 μg/ml）、環(huán)磷酰胺（CP，活化系統(tǒng)，40 mg/ml）作為陽性對照。取對數(shù)生長期的CHL細胞，在加S9與不加S9混合液的條件下進行，短期接觸組細胞與供試液或?qū)φ找航佑|6 h，隨后更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，持續(xù)接觸組細胞與供試液或?qū)φ找航佑|24 h，收獲細胞前3 h用秋水仙素處理細胞，隨后胰酶處理成細胞懸液，進行低滲處理后固定，用1～2滴細胞懸液滴片，自然干燥后用5 %吉姆薩染液染色，鏡下觀察并記分，進行染色體畸變分析。試驗組和對照組各分析200個分散良好的中期分裂相，陽性組記錄100個分散良好的中期分裂相。

3 結(jié)果

3.1 Ames試驗結(jié)果

平板計數(shù)，所有平皿背景生長良好，菌株自發(fā)回變菌落數(shù)在本實驗室鑒定范圍內(nèi)（見表1）；陽性對照組回變菌落平均值為介質(zhì)對照組回變菌落平均值的3倍以上；試驗組回變菌落平均值與對照組回變菌落平均值相比無明顯差異。故試驗組與對照組相比，該供試液對受試菌株TA97、TA98、TA100和TA102呈陰性反應（見表2）。

表1 回變菌落數(shù)鑒定范圍

表 2 Ames試驗結(jié)果（±s）

表 2 Ames試驗結(jié)果（±s）

組別 TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9試驗組 108±6.6 139±14.0 29±2.6 31±3.1 193±4.0 111±2.6 226±8.0 258±9.5陰性對照 107±10.1 130±13.4 28±2.3 28±2.5 99±11.2 105±7.0 272±10.6 221±15.1陽性對照 731±85.5 924±129.9 1177±107.2 2068±154.4 2349±258.0 2697±294.9 2286±120.0 2235±228.6

表3 體外小鼠淋巴瘤細胞突變試驗結(jié)果

3.2 體外小鼠淋巴瘤細胞突變試驗結(jié)果

介質(zhì)對照組的PE0在60 %～140 %范圍內(nèi)，PE2在70 %～130 %之間，試驗組與對照組比較，該供試液L5178Y TK+/- clone9（3.7.2C）細胞的突變頻率在S9代謝活化劑存在或不存在的情況下均低于介質(zhì)對照組的兩倍，試驗結(jié)果表明該試驗反應是陰性的（見表3）。

3.3 體外染色體畸變試驗結(jié)果

在加和不加S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，染色體畸變率與介質(zhì)對照相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明該供試液無致染色體畸變性（見表4）。

表4 染色體結(jié)構(gòu)畸變試驗結(jié)果

4 討論

亞甲藍是一種堿性生物染料，也是國家藥典收錄的靜脈注射藥物，臨床主要用于治療亞硝酸鹽中毒或診斷示蹤劑。在治療氰化物中毒時24 h總量不超過500 mg，靜脈注射劑量過大（＞500 mg）時可出現(xiàn)不良反應。血漿病毒滅活的亞甲藍用量為0.9～1.3 μmol/L，且在病毒滅活后還會用專門的一次性濾器濾除血漿中85 %以上的亞甲藍[5]，因此患者所接受的劑量遠在安全用量范圍以下。但亞甲藍經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物輸入人體是否產(chǎn)生未知的不良反應，如遺傳毒性、長期毒性等未見報道。本研究選擇羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為模擬液，并通過光照、過濾及儲存等臨床處理過程，評估光照后亞甲藍的殘留及其降解產(chǎn)物產(chǎn)生的遺傳毒性作用。

GB/T16886.12規(guī)定樣品制備時除推薦方法外，也可使用其他適合于器械的性質(zhì)和應用或適合于危害識別方法的浸提介質(zhì)[6]，故本研究沒有按GB/T16886.12中常規(guī)的樣品制備方法，而是按產(chǎn)品使用說明書的使用方法進行樣品制備。羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液在臨床上主要應用于大出血、大面積燒傷、重癥監(jiān)護或手術病人，具有快速、強效的擴容效應，用以擴充血容量，改善微循環(huán)，是臨床上廣泛使用的血漿代用品[7]。在本遺傳毒性試驗系統(tǒng)中，羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液作為對照組并未引起試驗體系發(fā)生變化。

本研究根據(jù)GB/T16886.3中遺傳毒性試驗方案1進行試驗[8]。Ames試驗從基因水平上反映了遺傳物質(zhì)受損傷情況。本研究結(jié)果顯示，在無論有無活化系統(tǒng)（S9混合液）存在情況下，TA97、TA98、TA100和TA102菌株回復突變菌落數(shù)均接近自發(fā)突變，與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示亞甲藍經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物在體外Ames試驗中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。小鼠淋巴瘤試驗以突變頻率作為指標，通過試驗樣品誘導小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y）tk基因受損傷而發(fā)生突變的請況，評價受試樣品潛在的致突變性。在本研究試驗條件下，亞甲藍經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物沒有引起小鼠淋巴瘤細胞克隆形成率的顯著升高。染色體畸變試驗以染色體畸變率作為指標，通過誘導細胞染色體發(fā)生畸變性評價材料潛在的致突變性。在本研究試驗條件下，亞甲藍經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物沒有引起細胞染色體畸變率的顯著升高。以上結(jié)果顯示，亞甲藍經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物在本次試驗條件下沒有潛在的遺傳毒性。