葉 夢(mèng) 賈冰冰 梁晨思 霍麗蓉

神經(jīng)纖維瘤病是一組常染色體顯性遺傳病，包括Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)，2型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 2，NF2)，神經(jīng)鞘瘤(schwannomatosis)。其中， NF2發(fā)病較少，發(fā)病基因Nf2位于22號(hào)染色體。神經(jīng)鞘瘤較為罕見(jiàn)，發(fā)病基因可能為INI1/SMARCB或LZTR1，兩者均位于22號(hào)染色體[1]。NF1最為常見(jiàn)，發(fā)病基因Nf1位于17號(hào)染色體。

一、Nf1基因與Nf1基因突變

Nf1(neurofibromatosis 1)基因定位于17q11.2，含60個(gè)外顯子，包含3個(gè)可變剪接(9a、23a、48a)，是人類(lèi)基因組中最大的基因之一，其DNA全長(zhǎng)超過(guò)280kb，翻譯產(chǎn)物——神經(jīng)纖維瘤蛋白(neurofibromin)相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)350000。在功能上，Nf1屬于抑癌基因。由外顯子21～27a編碼的Ras-GTP酶激活蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Ras-GTPase activating protein-related domain，GRD)能夠抑制Ras-GDP非活性形式轉(zhuǎn)化為Ras-GTP活性形式，并促進(jìn)其相反過(guò)程[2]。因此，神經(jīng)纖維瘤蛋白是Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。在Nf1-GRD區(qū)域上游，由外顯子11～17片段編碼的富含半胱氨酸/絲氨酸結(jié)構(gòu)域(cysteine-serine-rich domain, GSRD)編碼蛋白質(zhì)ATP結(jié)合位點(diǎn)以及3個(gè)潛在的cAMP依賴(lài)性蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，可以調(diào)控cAMP-PKA通路。另外，由外顯子13～14區(qū)段編碼的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated-protein, MAP)，可與微管結(jié)合并調(diào)控微管功能。

Nf1基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，突變多發(fā)。據(jù)人類(lèi)基因突變庫(kù)(Human Gene Mutation Database，HGMD)顯示，截至2015年，Nf1基因已有超過(guò)1400個(gè)突變，包括剪接突變、無(wú)義和錯(cuò)義突變，以及缺失、插入、易位和移碼突變。其中無(wú)義突變占多數(shù)。Nf1基因突變患者中50%的患者為自發(fā)突變，包括散發(fā)病例及家族性患者。然而Nf1基因突變?nèi)狈ν蛔儫狳c(diǎn)，這使得臨床表型與基因突變位點(diǎn)的關(guān)系研究困難重重。

二、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病及其相關(guān)血管病變

Nf1基因突變會(huì)導(dǎo)致Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)，發(fā)生率約為1/3000～1/2500，無(wú)性別、民族與種族差異[3]。其臨床表現(xiàn)多樣，以皮膚多發(fā)牛奶-咖啡色斑(cafe′-au-lait macules)、皮膚神經(jīng)纖維瘤、虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤(iris lisch nodules)等為典型特征。一些Nf1患者還會(huì)發(fā)生骨骼異常、腦腫瘤、周?chē)窠?jīng)腫瘤、學(xué)習(xí)障礙和注意力缺陷等。部分患者的表現(xiàn)局限于身體的一部分，稱(chēng)為“節(jié)段型”或“鑲嵌型”Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(mosaic neurofibromatosis 1)，這可能是由Nf1基因發(fā)生的突變?yōu)樘浩诘捏w細(xì)胞突變所致。

Nf1突變還會(huì)導(dǎo)致血管病變，盡管屬于NF1罕見(jiàn)并發(fā)癥，但由于后果嚴(yán)重，在近年來(lái)也逐漸受到關(guān)注。在不同的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，NF1相關(guān)血管病變?cè)贜F1患者中的發(fā)生率在0.4%～8.0%[4, 5]。其發(fā)病多于兒童期或成年早期開(kāi)始，主要累及腦、腎臟、腸系膜、冠狀動(dòng)脈及外周小血管，且多數(shù)患者受累血管不止一處，可導(dǎo)致血管狹窄、閉塞、動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈瘤破裂及血管瘺[6]。在這些血管病變中，腎動(dòng)脈病變最為常見(jiàn)(41%)，是導(dǎo)致NF1患者高血壓的主要原因。

約1/2 NF1相關(guān)血管病變死亡患者是由腦血管病導(dǎo)致。腦血管異常多是由頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈及大腦前動(dòng)脈的狹窄或閉塞引起，狹窄血管周?chē)纬傻臄U(kuò)張的毛細(xì)血管，在腦血管造影中顯示煙霧狀，即為煙霧病(moya-moya syndrome，MMS)，是兒童NF1患者最常見(jiàn)的腦血管病[7]。雖然NF1為單基因遺傳病，但有研究表明NF1相關(guān)MMS與同樣位于17號(hào)染色體上的RNF213 基因有密切關(guān)聯(lián)[8]。除了出現(xiàn)MMS外，NF1患者還會(huì)出現(xiàn)頸內(nèi)動(dòng)脈、椎動(dòng)脈、枕動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤以及動(dòng)靜脈瘺，但較為少見(jiàn)，且可以出現(xiàn)在老年患者中。腦部血管病變的臨床癥狀多為因缺血導(dǎo)致的乏力、不自主運(yùn)動(dòng)、頭痛及癲癇發(fā)作，兒童多見(jiàn)。成人也可出現(xiàn)類(lèi)似癥狀，需與顱內(nèi)出血鑒別診斷。

三、NF1相關(guān)血管病變的發(fā)病機(jī)制

神經(jīng)纖維瘤蛋白在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)、內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)和施萬(wàn)細(xì)胞(schwann cells)等中均有表達(dá)。Nf1基因突變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤蛋白表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致血管病變的發(fā)生。NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，根據(jù)已發(fā)表論著，整理如下：

1.神經(jīng)纖維瘤蛋白對(duì)于心血管的正常發(fā)育有關(guān)鍵作用:Nf1基因敲除小鼠因嚴(yán)重的心血管發(fā)育缺陷而發(fā)生胚胎致死，這曾被認(rèn)為是由于神經(jīng)嵴細(xì)胞Nf1基因的異常。但Aaron等發(fā)現(xiàn)，特異性敲除神經(jīng)嵴細(xì)胞Nf1基因，并不會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎心臟心內(nèi)膜墊和心肌發(fā)育異常，而特異性敲除ECs的Nf1基因卻能夠得到這樣的結(jié)果，揭示了ECs表達(dá)的神經(jīng)纖維瘤蛋白在心臟發(fā)育過(guò)程中有重要作用；另外，他們還在Nf1-/-小鼠心臟的心內(nèi)膜墊上發(fā)現(xiàn)了大量磷酸化的MAPK，這意味著MAPK重要激活通路——Ras-MAPK通路的上調(diào)。神經(jīng)纖維瘤蛋白在心外膜EMT過(guò)程中也起關(guān)鍵調(diào)控作用。心外膜在發(fā)育的過(guò)程中發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這是冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源。Baek等[9]特異性地敲除心外膜Nf1基因后，發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致心臟更早地、自發(fā)地發(fā)生心外膜EMT，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致血管發(fā)育不良。

2.神經(jīng)纖維瘤蛋白的缺乏導(dǎo)致多種血管生長(zhǎng)因子增加:腫瘤的進(jìn)展多是由于各種血管生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)。研究表明NF1患者VEGF及bFGF水平明顯升高。VEGF家族是脈管系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，能夠誘導(dǎo)血管、淋巴管的生成，血管內(nèi)膜重排并能趨化VSMCs、ECs，這些都能促進(jìn)新血管的形成。而NF1患者VEGF表達(dá)上調(diào)是由Nf1基因單倍體不足直接導(dǎo)致，而不是由 mTOR-HIF-1α-VEGF信號(hào)通路介導(dǎo)[10]。bFGF與VEGF相似，在介導(dǎo)損傷后新生血管的生成具有重要作用。Muir等的研究也從NF+/-小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了過(guò)量bFGF的表達(dá)。

3.血管細(xì)胞及骨髓源性細(xì)胞的異常增殖與遷移導(dǎo)致血管的狹窄與阻塞

(1)VSMCs及ECs的異常增殖與遷移:NF1相關(guān)血管病變的典型病理表現(xiàn)就是VSMCs及ECs的異常增殖與遷移。盡管不同血管病變的病理改變不完全相同，如動(dòng)脈狹窄是平滑肌細(xì)胞增殖和向內(nèi)重塑的結(jié)果，動(dòng)脈瘤則是血管平滑肌細(xì)胞凋亡和向外重塑的結(jié)果。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NF1雜合小鼠血管ECs對(duì)有絲分裂元的反應(yīng)十分敏感，ECs增殖及遷移明顯增多，新血管生成增加。他們還在增殖的血管中發(fā)現(xiàn)了大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞，并認(rèn)為這種變化發(fā)生在血管增生之后。Bajaj等[2]的研究則表明Nf1基因的缺失會(huì)直接導(dǎo)致受損ECs自動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞周期。Li的科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)給予Nf1+/-小鼠格列衛(wèi)(Gleevec，PDGF-BB-Ras-Erk通路抑制劑)能夠減少VSMCs的增殖與遷移及Erk的激活，提示神經(jīng)纖維蛋白通過(guò)PDGF-BB-Ras-Erk信號(hào)軸維持著血管壁的穩(wěn)定。Jousma等[11]研究表明， Erk抑制劑不能阻止神經(jīng)纖維瘤的生長(zhǎng)，但是能夠抑制腫瘤早期的生長(zhǎng)，減少腫瘤血供。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)VSMCs Nf1基因特異性敲除小鼠的血管尚能夠正常生長(zhǎng)，在血管損傷時(shí)，平滑肌細(xì)胞才表現(xiàn)出內(nèi)膜的異常，表現(xiàn)為內(nèi)膜增厚及新血管生成。這是由于血管損傷后，Ras及其下游效應(yīng)物異常激活，而GRD結(jié)構(gòu)域的表達(dá)能夠挽救這種變化。另有研究表明，神經(jīng)纖維瘤內(nèi)的干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF，也稱(chēng)KitL)過(guò)量表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其主要由施萬(wàn)細(xì)胞(schwann cells)產(chǎn)生;在Nf1+/-肥大細(xì)胞中，KitL是促進(jìn)其遷移的主要因子。在Nf1-/-造血干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GAP 相關(guān)結(jié)構(gòu)域(GAP related domain, GRD)發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞的增殖顯著減少。

(2)單核-吞噬細(xì)胞參與的炎癥、氧化應(yīng)激機(jī)制：Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)雜合VSMCs或ECs的Nf1基因均不會(huì)引起損傷后心血管的生成和血管壁的增厚，但骨髓源性細(xì)胞(bone marrow-derived cells，BMDCs)Nf1基因缺失則會(huì)導(dǎo)致這樣的后果，且在新生血管內(nèi)80%以上的BMDCs為巨噬細(xì)胞，另外VSMCs能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)一步加重血管病變，這樣的發(fā)現(xiàn)也符合臨床無(wú)任何血管病變臨床癥狀的NF1患者外周血炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞)及炎性因子(如IL-6、IL-1、Fractalkine)增多的現(xiàn)象，提示單核-吞噬細(xì)胞在NF1患者中血管病變中起到的核心作用[12]。Li等[13]還發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞Nf1基因雜合小鼠動(dòng)脈瘤形成增加、髓系細(xì)胞(myeloid cells)增多以及氧化應(yīng)激增強(qiáng)。

Bessler等[14]通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)闡述了炎癥及氧化應(yīng)激在NF1血管損傷中的作用機(jī)制。巨噬細(xì)胞能夠直接產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，Ras活性增高也能提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。使用NADPH氧化酶-2抑制劑能夠抑制Nf1+/-小鼠新內(nèi)膜的形成及VSMCs的增殖與遷移。很多NF1患者盡管無(wú)血管病癥狀，但是外周血單核細(xì)胞增多，細(xì)胞核DNA氧化損傷增加，即慢性暴露于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致SMCs的增殖與遷移。Bessler等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，僅敲除單核-吞噬細(xì)胞的Nf1基因即可構(gòu)造NF1相關(guān)血管病變模型，且能夠動(dòng)員單核細(xì)胞趨化因子受體-2(CCR-2)進(jìn)入外周血。CCR-2是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的主要受體，MCP-1是募集和活化單核細(xì)胞最重要的趨化因子。MCP-1越多，Nf1+/-巨噬細(xì)胞增殖與遷移越多，Ras激酶表達(dá)越多。巨噬細(xì)胞自身也分泌VEGF，另外，VSMCs也表達(dá)CCR2，進(jìn)一步促進(jìn)血管的再生。給予Nf1+/-小鼠CCR2拮抗劑，能夠有效減少新內(nèi)膜的形成。這表明MCR-1/CCR-2信號(hào)軸對(duì)單核-吞噬細(xì)胞的募集作用在新內(nèi)膜的形成及血管損傷中有重大作用，為NF1血管病的治療提供了可行的靶點(diǎn)。Debra等[16]研究也證實(shí)了氧化應(yīng)激在NF1患者新血管形成過(guò)程中的重要作用，并且抗氧化治療能夠挽救Nf1+/-小鼠血管表型。另外，Nf1基因突變的施萬(wàn)細(xì)胞分泌KIT 配體增多，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)[17]。TGF-β對(duì)巨噬細(xì)胞也有極強(qiáng)的趨化作用，進(jìn)一步證明炎性細(xì)胞在血管形成過(guò)程中的重要作用。

總之，Nf1基因?qū)τ谘艿陌l(fā)育及生長(zhǎng)極其重要，作為Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)纖維瘤蛋白的減少直接或間接促進(jìn)各種生長(zhǎng)因子和炎性因子的激活,從而導(dǎo)致血管壁的增厚和新血管的形成，造成血管的各種病變。

四、動(dòng)物模型

隨著研究的深入，NF1相關(guān)血管病變動(dòng)物模型不斷建立，每一種新模型的建立都意味著對(duì)NF1相關(guān)血管病變形成機(jī)制更深入、更全面的理解。1990年，Nf1基因被成功克隆，隨后成功構(gòu)建Nf1基因的突變體。1994年發(fā)現(xiàn)Nf1-/-小鼠由于心臟發(fā)育異常導(dǎo)致胚胎致死。2003年，Aaron等通過(guò)cre/loxp系統(tǒng)，特異性敲除血管內(nèi)皮Nf1基因(Nf1 ec)，也發(fā)現(xiàn)Nf1 ec小鼠及Nf1基因敲除小鼠胚胎致死，并且發(fā)現(xiàn)兩者心臟出現(xiàn)了相同的改變，由此構(gòu)建了NF1血管病的小鼠模型，并證明內(nèi)皮細(xì)胞在血管形成中有重要作用。有相關(guān)研究通過(guò)Nf1+/-小鼠的頸總動(dòng)脈內(nèi)皮剝離及血管拉伸，成功構(gòu)造Nf1+/-小鼠血管損傷模型。Bessler等[15]還通過(guò)敲除單核-吞噬細(xì)胞Nf1基因，也成功構(gòu)造了小鼠NF1相關(guān)血管病變模型。

除了小鼠模型，Padmanabhan等[18]在斑馬魚(yú)15號(hào)染色體(Nf1a)和10號(hào)染色體(Nf1b)中發(fā)現(xiàn)了與人類(lèi)Nf1基因十分相似的基因片段。而斑馬魚(yú)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)允許對(duì)其血管異常的進(jìn)展情況從胚胎期開(kāi)始進(jìn)行觀測(cè)，便于對(duì)NF1相關(guān)血管病變的結(jié)構(gòu)-功能進(jìn)行分析及遺傳篩選。

另外，小型豬具有與人類(lèi)十分相似的心血管系統(tǒng)，可以作為研究NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機(jī)制及藥物篩選的理想動(dòng)物模型。然而國(guó)內(nèi)外對(duì)此仍研究較少，Meyerholz等[19]通過(guò)對(duì)NF1可能的生物標(biāo)記進(jìn)行免疫組化，包括β-tubulin Ⅲ， PCNA及caspase-3等15種生物標(biāo)記，填補(bǔ)了Nf1轉(zhuǎn)化豬研究的空白。

五、展 望

隨著研究的深入，人們對(duì)Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病血管病變的臨床、病理特點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制的了解在過(guò)去的25年發(fā)生了突破性的進(jìn)展，也為其治療帶來(lái)了眾多指導(dǎo)性建議，例如口服辛伐他汀或抗氧化夾竹桃麻素(antioxidant apocynin)能夠減少Nf1+/-小鼠動(dòng)脈瘤形成；給予Nf1+/-小鼠NO合酶(NOS)拮抗劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯或抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸能夠改善小鼠NF1血管表型等。另外，也有很多關(guān)于NF1相關(guān)血管病變外科治療成功的報(bào)道，例如通過(guò)使用血管內(nèi)栓塞線(xiàn)圈和醫(yī)用黏合劑(N-丁基-2-氰基丙烯酸酯)成功治療腰動(dòng)脈動(dòng)脈瘤破裂，Bargiela等也證實(shí)血管內(nèi)治療(包括栓塞線(xiàn)圈、血管內(nèi)支架、球囊擴(kuò)張器等)對(duì)于不同年齡段NF1相關(guān)血管病變患者是安全而有效的。

盡管這些治療手段多停留在實(shí)驗(yàn)階段或只是少數(shù)的病例報(bào)道，但隨著對(duì)NF1相關(guān)血管病變發(fā)病機(jī)制不斷深入地了解，必將揭開(kāi)NF1相關(guān)血管病變的神秘面紗，從而獲得有效的治療途徑。