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        陽離子光敏抗菌型水凝膠的制備及性能表征

        2019-02-23 03:39:16董建成葛孝棟王清清魏取福
        材料工程 2019年2期
        關鍵詞:效果

        董建成,葛孝棟,王清清,魏取福

        (江南大學 生態(tài)紡織教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

        近年來,細菌感染屢見不鮮,耐藥性病株的出現(xiàn)使得人們對于一些感染病例束手無策,迫切需要開發(fā)新的抗菌劑及研究方法來解決這個問題。常用的抗菌劑有重金屬[1]、季銨鹽[2]、殼聚糖[3]等,但這些常規(guī)抗菌劑往往會產(chǎn)生耐藥性。光動力抗菌化學療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[4]作為最具前景的新療法之一,有望替代抗生素和常規(guī)抗菌劑用于感染方面的治療。PACT基于光動力療法(photodynamic therapy, PDT),利用光敏劑在可見光的照射下產(chǎn)生光毒性單線態(tài)氧(1O2)滅活微生物。1O2沒有特異性的靶目標,因此PACT在滅菌的過程中不易使微生物產(chǎn)生耐藥性[5]。PACT常用的光敏劑有亞甲基藍、卟啉類等,由于自身所帶的正電荷使得其對細菌具有良好的抗菌效果[5]。將光敏劑固定化,為其持續(xù)和可重復利用提供了條件。目前,光敏劑在殼聚糖、硅膠、甲基丙烯酸衍生物等各種載體上的固定化已被廣泛研究[6-7]。但關于陽離子光敏劑在水凝膠基材上的負載,其用于光動力抗菌方面的研究較少。相比于其他的材料,水凝膠具有良好的生物相容性、可加工性、特定的刺激響應性。用其作為基體材料可以通過多種方式實現(xiàn)光敏劑的固定化,在諸多領域具有廣泛的用途[8]。

        本工作首先通過MMT特有的層間陽離子交換性能,分別吸附3種陽離子光敏劑,然后將其均勻分散在PVA-SbQ溶液中,然后利用紫外光交聯(lián)法,使SbQ基團發(fā)生光二聚反應,分子鏈之間發(fā)生交聯(lián),形成具有三維網(wǎng)絡結構的水凝膠。分析光交聯(lián)過程中光照時間對光敏劑性能的影響及水凝膠的溶脹性能,最后探究3種水凝膠對金黃色葡萄球菌的光敏抗菌效果。

        1 實驗材料與方法

        1.1 實驗材料

        PVA-SbQ(苯乙烯吡啶鹽的摩爾分數(shù)為4.1%),上海廣毅印刷器材科技有限公司;無機納米蒙脫土,浙江豐虹新材料股份有限公司;亞甲基藍(MB)、meso-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩對甲苯磺酸鹽(TMPyP)、meso-四(N-甲基-4-吡啶)卟吩四氯化鋅(Zn-TMPyP),上海維塔試劑有限公司;金黃色葡萄球菌(ATCC6538),上海協(xié)久生物科技有限公司;PBS緩沖液(pH=7.4),自制;去離子水,江南大學后勤管理中心。

        1.2 紫外光交聯(lián)法制備光敏抗菌型水凝膠

        經(jīng)反復超聲處理配制0.1%(質量分數(shù))的MMT溶液,然后分別取1mL濃度為100μmol/L的TMPyP,Zn-TMPyP,MB水溶液和1mL的MMT溶液加入燒杯,攪拌均勻后加入5mL質量分數(shù)為50%的PVA-SbQ水溶液,磁力攪拌30min后,將混合溶液轉移到聚PTFE培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿上方覆蓋一層保鮮膜防止水分蒸發(fā),最后將其放置在氙燈(配置365nm濾光片)下照射2h,得到光敏抗菌型水凝膠。

        1.3 光敏劑光漂白測試

        分別配制濃度為25μmol/L的TMPyP,Zn-TMPyP水溶液和50μmol/L的MB水溶液。以去離子水的吸收光譜作為基線,掃描波長范圍為300~650nm。分別取4mL對應的光敏藥物溶液在氙燈(配置365nm濾光片)下照射1~5h,每小時掃描一次溶液的吸收光譜。同樣的方法,移除365nm濾光片,配置420nm濾光片(λ≥420nm)在氙燈下照射0~120min,每隔10min在波長420.7,434.8,664nm處測3種溶液的吸光度變化。

        1.4 水凝膠溶脹性能測試

        將所得3種水凝膠凍干膜裁剪成小塊,每種水凝膠膜分為3個平行組。把水凝膠膜浸沒在過量去離子水中,在25℃恒溫水浴鍋中放置,每隔1h取出水凝膠,用濾紙拭去表面的水分,然后在電子天平上稱重,直至達到溶脹平衡。水凝膠溶脹比S為:

        (1)

        式中:WR,W0分別為每小時水凝膠吸水后的質量和干凝膠的質量。

        1.5 抗菌測試

        參考AATCC 100-2012對水凝膠光敏抗菌性能進行評價。在水凝膠凍干膜樣品上剪取若干個形狀、厚度均一的圓形試樣,平鋪于24孔板內(nèi)。取0.1mL濃度為1×108~3×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液(PBS緩沖液)接種在各試樣上。每個樣品均分為兩組,分別置于光照及暗室的環(huán)境下培養(yǎng)30min,隨后在含有試樣的對應的24孔板內(nèi)加入0.9mL PBS緩沖液,混合均勻后將原菌液及試樣上的菌液在離心管中依次等梯度稀釋106倍,制作出10倍稀釋系列。分別從稀釋系列的各離心管中取10μL溶液注入含瓊脂培養(yǎng)基的平板上,置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。最后對其菌落數(shù)測定,計算出細菌存活率,對抗菌效果進行評價。

        1.6 其他分析測試

        用S-4800型掃描電子顯微鏡進行水凝膠表面形貌分析;用JEOL-2010型透射電子顯微鏡對MMT和水凝膠進行表征;用Q500熱重儀分析水凝膠的熱性能(升溫速率為10℃/min,最高溫度為600℃)。

        2 結果與分析

        2.1 水凝膠的形貌結構

        圖1為TMPyP,Zn-TMPyP和MB 3種光敏劑的水凝膠的實物圖與SEM圖。由圖1(a-1),(b-1),(c-1)可知,水凝膠的外觀均質透明,勻整統(tǒng)一,3種水凝膠均呈現(xiàn)出光敏劑特征的顏色屬性。MMT通過層間陽離子交換作用吸附光敏劑[9],避免了光敏劑團聚現(xiàn)象的產(chǎn)生[10],這是均質水凝膠成型的基礎。

        圖1 TMPyP(a),Zn-TMPyP(b)和MB(c)水凝膠的實物圖與SEM圖(1)實物圖;(2)縱切面;(3)橫切面Fig.1 Digital images and SEM images of TMPyP(a),Zn-TMPyP(b) and MB(c) hydrogels(1)digital images;(2)longitudinal sectional images;(3)cross sectional images

        由圖1(b-2),(c-2)縱切面觀察到,水凝膠具有聯(lián)通的多孔三維網(wǎng)絡結構,圖1(b-3),(c-3)的橫切面形成連續(xù)的片層結構,MMT/TMPyP水凝膠電鏡圖尤為明顯。這是由于在冷凍過程中,凝膠中的水在低溫條件下成核結晶,形成冰峰,隨著熱量的傳遞,冰峰逐漸接近凝膠表面,形成貫通的冰柱,低壓條件下冰柱干燥升華,形成水凝膠的多孔結構[11-12]。這種多孔結構極大增加了水凝膠的比表面積,有利于光敏劑的釋放及其與底物接觸。

        圖2為MMT,MMT/TMPyP水凝膠的TEM圖。

        從圖2(a)中可以看出,經(jīng)過超聲處理后,MMT片層結構被撐開,顯示出MMT的片層條紋結構,顏色較深的是MMT片層,顏色較淺的為片層間隙[13]。圖2(b)中吸附TMPyP的片層MMT均勻分散在PVA-SbQ載體中,從微觀層面說明了圖1中均質穩(wěn)定水凝膠的成型。

        圖2 MMT(a),MMT/TMPyP(b)水凝膠的TEM圖Fig.2 TEM images of MMT(a) and MMT/TMPyP(b) hydrogels

        2.2 光敏劑的光漂白

        圖3為3種光敏劑的紫外光及可見光漂白曲線。光漂白是指光敏劑與光子相互作用時,除生成1O2外,還會伴隨著發(fā)生光降解、光締合等其他光化學副反應[14],破壞光敏劑的分子結構,降低光敏化能力。圖3(a),(b),(c)分別為TMPyP,Zn-TMPyP,MB的紫外光漂白曲線??梢钥闯?,即使經(jīng)過5h的紫外光照射,光敏劑的吸收曲線均沒有發(fā)生明顯降低,保證了水凝膠制備過程中光敏劑的光敏化性能。

        圖3(d)為3種光敏劑的可見光漂白曲線??芍?,在可見光照射下(λ≥420nm),3種光敏劑均發(fā)生部分光降解。兩種卟啉類光敏劑較為穩(wěn)定,而MB光降解達到49.7%。MB是氮硫雜蒽化合物形成的三環(huán)狀結構,而卟啉是由26個π電子形成的高度共軛大環(huán)結構,因此卟啉的穩(wěn)定性高于MB。與TMPyP相比,Zn-TMPyP中Zn2+的存在使得卟啉環(huán)在與光子的相互作用中更容易產(chǎn)生電子躍遷[15],因此Zn-TMPyP的降解速率高于TMPyP。

        圖3 TMPyP,Zn-TMPyP和MB光敏劑的紫外光及可見光漂白曲線(a),(b),(c)TMPyP,Zn-TMPyP,MB的紫外光漂白曲線;(d)3種光敏劑的可見光漂白曲線Fig.3 UV bleaching curves and visible light bleaching curves of the TMPyP,Zn-TMPyP and MB photosensitizers(a),(b),(c)UV bleaching curves of the TMPyP,Zn-TMPyP and MB;(d)visible light bleaching curves of the three photosensitizers

        2.3 水凝膠的溶脹性能

        圖4為3種光敏水凝膠的溶脹性能曲線。可知,3種水凝膠的溶脹趨勢基本一致,隨著時間的增加,溶脹速率都呈線性增長,12h后基本達到溶脹平衡,3種水凝膠平衡溶脹比迥異。溶脹過程中,水分子從外部滲透到水凝膠體系內(nèi),使其溶脹,同時聚合物分子鏈的擴展使三維網(wǎng)絡結構受到應力作用,使分子網(wǎng)產(chǎn)生收縮趨勢,當兩種相反的傾向相互抵消時,達到了溶脹平衡[16-17]。3種水凝膠的平衡溶脹比大小不同,可能與光敏劑分子量大小相關。TMPyP,Zn-TMPyP和MB分子量依次降低,與MMT結合后形成的粒徑大小也依次降低,因此MMT/PS在水凝膠中填充的網(wǎng)絡空隙大小不同,當水凝膠浸沒在水中時,部分MMT/PS會脫離出來,對應的網(wǎng)絡空隙由水分子填充。TMPyP,Zn-TMPyP和MB水凝膠的網(wǎng)絡空隙逐漸減小,因此對應溶脹比依次減小。

        圖4 3種光敏水凝膠的溶脹性能Fig.4 Swelling property of the three photoactive hydrogels

        2.4 水凝膠的熱學性能

        圖5 3種光敏水凝膠的TGA曲線和TMPyP水凝膠的DTG曲線Fig.5 TGA curves of the three photoactive hydrogelsand DTG curve of the TMPyP hydrogel

        2.5 水凝膠的光敏抗菌性能

        圖6為3種光敏水凝膠對金黃色葡萄球菌的抗菌效果??梢钥闯?,水凝膠對金黃色葡萄球菌均具有一定的殺滅效果。在光照及暗室培養(yǎng)環(huán)境下,對照組均未產(chǎn)生抗菌效果,而復合了光敏劑的Zn-TMPyP,TMPyP和MB水凝膠,在可見光照射條件下(λ≥420nm)細菌的存活率分別為1.51%,47.26%,74.58%,對應光敏劑游離時的1O2量子產(chǎn)率分別為0.88,0.74,0.49[20]。光敏劑的1O2量子產(chǎn)率越高,其光動力抗菌效果越佳,然而光敏劑被負載后光敏化性能下降[5]。負載MB的水凝膠光敏抗菌性能較差,可能是由于30min光照使其部分光降解,導致其光敏化能力降低。光照30min后,2種卟啉光敏劑的降解率較低,但TMPyP水凝膠的殺菌效果一般,可能是因為其1O2量子產(chǎn)率低于Zn-TMPyP,被負載后量子產(chǎn)率進一步降低。Zn-TMPyP對金黃色葡萄球菌的殺滅效果達到98.49%,具有最好的抗菌效果。一方面是因為高1O2量子產(chǎn)率,另一方面,Zn-TMPyP中Zn2+對細菌有一定殺滅效果。在暗室條件下,水凝膠有一定的抑菌效果,這可能是由于光敏劑穿透細菌細胞壁,進入細胞內(nèi)對細菌DNA產(chǎn)生損害導致細菌裂解所致[21]。

        圖6 3種光敏水凝膠對金黃色葡萄球菌的抗菌效果Fig.6 Antibacterial effects of the three photoactive hydrogels against staphylococcus aureus

        3 結論

        (1)成功制備了TMPyP,Zn-TMPyP和MB 3種陽離子光敏抗菌水凝膠。其外觀均質透明、勻整統(tǒng)一。制備過程中,紫外輻射不會影響光敏劑光敏化性能,冷凍干燥后內(nèi)部形成聯(lián)通的三維網(wǎng)絡多孔結構,具有良好的溶脹性能。

        (2)3種光敏水凝膠熱分解性能基本一致,光敏劑的存在不會影響載體熱學性能。

        (3)Zn-TMPyP水凝膠具有最佳的光敏抗菌效果,其對金黃色葡萄球菌的殺滅效果達到98.49%,另外2種水凝膠也具有一定的抑菌效果。

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