初僑，席興軍，董跟來，趙新穎，王尉，王風(fēng)賀，張維冰，蘭韜*

(1.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)與食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京 100191；2. 亞東信基(北京)農(nóng)產(chǎn)品有限公司，北京 100125；3.北京市理化分析測試中心，北京 100089；4. 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023；5. 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

天麻為我國常用名貴中藥材，是多年生蘭科草本植物天麻的干燥根塊，主產(chǎn)于貴州、陜西、云南、四川、湖北等地，具有平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛的功效，主治風(fēng)癇、驚氣等引起的頭風(fēng)頭痛、半身不遂、小兒驚癇動風(fēng)、風(fēng)濕痹癥[1-2]。天麻中含有天麻素、天麻苷元、天麻醚苷等成分[3-4]，其中天麻素是天麻的主要有效成分，含量通常可高達0.33%～0.67%，具有較好的鎮(zhèn)靜、安神作用，常被用作天麻藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[5-9]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-羥甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[10-12]。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有可在時空兩個領(lǐng)域進行量值傳遞的特征，因此在分析方法評價、測量結(jié)果及儀器驗證的準(zhǔn)確性保證方面具有重要作用，對于分析化學(xué)和臨床分析尤其重要[13-16]。天然產(chǎn)物類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以為我國特有的中藥材產(chǎn)品質(zhì)量控制和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性提供保證[17-18]。此類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要通過分離精提的方法從中藥材或其提取物中制備，使目標(biāo)產(chǎn)物的純度達到98%以上，經(jīng)定性確定為該目標(biāo)物后再經(jīng)均勻性、穩(wěn)定性檢驗和定值分析制備獲得。隨著中醫(yī)藥以及保健品行業(yè)的復(fù)蘇，社會對此類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求也在不斷增加。而天然產(chǎn)物類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大多來源于中草藥提取物，存在不同來源、種類、結(jié)構(gòu)的中草藥有效成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法差異較大、提取工藝復(fù)雜、成本高、某些成分穩(wěn)定性較差等問題，制約了此類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的發(fā)展。

以天麻素為代表的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價格較為昂貴，為了擴充標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類，降低標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用成本，滿足天麻等相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制工作的需求，本文依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范(JJF 1343—2012)[19]以及 ISO導(dǎo)則34、35的技術(shù)要求[20-21]，制備了天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(圖1)，以紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振波譜等4種方法對制備的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定性分析，同時以高效液相色譜方法進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗，最后對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行了定值分析。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

EClassical 3100高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；LC-6AD型制備液相色譜儀(日本島津公司)；HT7100系列制備液相色譜系統(tǒng)(蘇州匯通色譜分離純化有限公司)；Spectrum 400傅里葉變換紅外光譜儀(美國珀金埃爾默公司)；UV-4501型紫外可見分光光度計(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；1100 Series LC/MSD Trap高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)；Milli-Q超純實驗室用水機(德國默克密理博公司)。

天麻：市購；甲醇、乙腈：色譜級，德國默克公司；實驗所用其他試劑均為分析純；超純水為實驗室自制。

1.2 樣品制備

首先以蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖為原料，將其粉碎至100目粉末，精密稱取10 g置索氏提取器中，加無水乙醇60 mL，連續(xù)回流6 h，回收無水乙醇，殘渣用無水乙醇溶解濾過，濾液置于50 mL容量瓶中，用少量無水乙醇多次洗滌容器和濾器，合并洗滌液，用無水乙醇定容，搖勻。向其中加入30 mL石油醚，攪拌30 min，攪拌結(jié)束后靜置10 min，分液得到下層脫脂后的溶液，將脫脂后的溶液旋轉(zhuǎn)蒸干得浸膏，加入石油醚定容到10 mL，加入5 mL水飽和的正丁醇，攪拌10 min，攪拌結(jié)束后靜置分液，取下層正丁醇層得天麻提取液。

1.3 定性方法

制備的天麻素高純單體化合物經(jīng)紫外光譜分光光度法、傅里葉變換紅外-近紅外光譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法和核磁共振波譜法定性。紫外-可見分光光度計測定提取物的紫外光譜時以乙腈為溶劑，于0～400 nm波長下掃描得提取物的紫外光譜圖。采用KBr壓片法制備提取物的紅外檢測樣品，以傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀測定提取物的紅外光譜圖。采用高分辨飛行時間質(zhì)譜儀在正、負(fù)離子模式下測定提取物的質(zhì)譜圖。以DMSO-d6(含TMS)為氘代試劑，采用400 MHz核磁共振波譜儀測定得到25 ℃下提取物的氫譜和碳譜。

1.4 純度定值方法

2 方法與結(jié)果

2.1 天麻中天麻素的提取

以天麻提取液為原料，采用制備液相色譜制備得到天麻素精提物，以天麻素提取液、天麻素精提物以及天麻素標(biāo)準(zhǔn)品為樣品進樣，以1.4中純度定值方法中的色譜條件進行色譜分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，天麻素標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間與天麻提取液中保留時間在5.08～5.43 min內(nèi)的色譜峰相一致，說明此峰為天麻素的色譜峰，制備得到的天麻素精提物的保留時間也與天麻素對照品的保留時間一致，且純度較高。

圖2 天麻素提取液、天麻素精提物和天麻素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the extract of gastrodin, refined extract of gastrodin and control gastrodin

2.2 定性分析

制備的天麻素高純提取物經(jīng)紫外光譜分光光度計、傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀、高效液相色譜-質(zhì)譜儀和核磁共振波譜儀完成定性。

天麻素精提物的紫外譜圖如圖3所示，在220 nm處有最大吸收波長。

圖3 天麻素紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrogram of gastrodin

天麻素正離子模式下質(zhì)譜圖如圖4所示，檢測結(jié)果：m/z=287.128 5 [M+H]+，m/z=573.128 6[2M+H]+，結(jié)果與天麻素的分子量286.227 8相符。

圖4 天麻素正離子模式下質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrogram of gastrodin under positive ion mode

天麻素的1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ： 6.97 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, 6), 7.22 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3, 5), 4.42 (2H, s, H-7), 4.82 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1′), 3.21～3.29 (4H, m, Glc-H-2′, 3′, 4′, 5′), 3.68 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-6a′), 3.45 (1H, dd,J= 4.8, 2.0 Hz, H-6b′)；13C-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：156.8 (C-1), 116.4 (C-2, 6), 128.2 (C-3, 5), 136.3 (C-4), 63.0 (C-7), 101.0 (C-1′), 73.7 (C-2′), 77.5 (C-3′), 70.2 (C-4′), 77.1 (C-5′), 61.2 (C-6′)，與文獻[22]中數(shù)據(jù)一致。

2.3 均勻性檢驗

根據(jù)JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[19]標(biāo)準(zhǔn)中對均勻性檢驗方法的要求，對制備的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性進行檢驗。采取隨機抽樣、多次測量的策略，從天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分裝的200個小瓶中隨機抽取其中11小瓶，每瓶中取樣3次，每次取樣量為5 mg，用色譜甲醇配制為1 mL溶液，進行高效液相色譜分析，以色譜峰面積所占百分比作為樣品的純度值，進行瓶內(nèi)和瓶間的均勻性檢驗，結(jié)果如表1、表2所示。

表1 天麻素均勻性檢驗的測定數(shù)據(jù)

表2 天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性研究方差分析結(jié)果

由表2可知，當(dāng)υ1=10，同時υ2=22時，查F表，得F0.05(10,22)=2.30，由于F= MS間/MS內(nèi)=1.77

2.4 穩(wěn)定性檢驗

制備的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在樣品分裝后，于4 ℃保存。本文考察了制備后的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在兩年內(nèi)的穩(wěn)定性，每6個月取樣一次進行檢測，方法同均勻性檢驗，每個樣品檢測5次，以5次檢測結(jié)果的平均值為檢測結(jié)果，如表3所示。

表3 長期穩(wěn)定性檢驗實驗結(jié)果(n=5)

從天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)可以看出，樣品的純度隨著時間推移略有下降，但降低非常不明顯，仍處于正常范圍內(nèi)，以直線的線性關(guān)系為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，考察線性關(guān)系的斜率隨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性變化的變化值，以此變化值對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性進行預(yù)測。該線性關(guān)系的斜率值計算如下：

直線上的點的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

與斜率相關(guān)的不確定度為：

自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布因子t等于3.182。

由于|β1|

該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性不確定度的貢獻為：us=s(β1)×t=0.05%。

2.5 定值結(jié)果

所制備的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)8家實驗室聯(lián)合實驗定值，本次參加定值的實驗室均為北京市內(nèi)高校和科研院所的分析實驗室，分別為北京市理化分析測試中心、島津分析中心、中國科學(xué)院過程工程研究所、北京工業(yè)技師學(xué)院、北京化工大學(xué)、首都師范大學(xué)、北京工商大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法為隨機抽取16瓶樣品，每個參與定值的實驗室隨機送樣2瓶，每瓶樣品采樣3次，進行3次測定，每家參與實驗室提供6個測量數(shù)據(jù)，本次定值分析8家參與實驗室均采用高效液相色譜-面積歸一化法的定值方法，每家實驗室在該方法的基礎(chǔ)上選取的色譜條件略有改變，各實驗室匯總后的定值數(shù)據(jù)及其方差分析結(jié)果如表4所示。

首先，對8組純度定值結(jié)果進行格拉布斯(Grubbs)檢驗以剔除可疑值，計算得Gmax=1.212；Gmin=1.515，查格拉布斯臨界值表知：G0.05(8)=2.126。因Gmax、Gmin均小于G0.05(8)，檢驗結(jié)果為合格。

由于高效液相色譜-面積歸一法具有一定的局限性，故分別采用卡爾·費休法、灼燒殘渣法、頂空氣相色譜法對樣品中的水分、灰分和溶劑殘留進行檢測，以扣除上述雜質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程的影響。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分含量為0.063%，灰分含量為0.082%，揮發(fā)性溶劑殘留未檢出。

因此，天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為99.7%。

表4 天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度定值結(jié)果(n=6)

2.6 不確定度結(jié)果

本研究中所制備的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要是制備過程中不均勻性引起的、儲存和運輸過程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不穩(wěn)定性造成的以及定值過程中引入的。

(1)制備過程中不均勻性引起的不確定度為：

ubb=sbb=0.01%。

(2)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察時間為24個月，在儲存和運輸過程中存在的不確定度為：

us=s(β1)×t=0.05%。

(3)定值時產(chǎn)生的不確定度包括：i.將合作實驗室的平均值作為一組新的測量值，該組測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為不確定度來源之一，u1= 0.20%；ii.液相色譜響應(yīng)因子引入的不確定度為u2=0.2%；iii.由于在定值方法研究過程中樣品的進樣量均在檢測器的檢測線性范圍內(nèi)，故儀器檢出限引起的不確定度可忽略不計；iv.由于水分含量、灰分含量、溶劑殘留的測定值均小于0.1%，此部分的不確定度可忽略不計。

擴展不確定度為UCRM=k×uCRM=0.6%，其中k=2。

3 結(jié)論

本文采用半制備液相色譜系統(tǒng)從天麻提取液中分離純化了天麻素，并以紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等手段對分離純化后的物質(zhì)進行了定性分析，確定所制備的物質(zhì)是天麻素。以高效液相色譜法結(jié)合面積歸一化法對該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性進行了考察，考察結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性較好，同時該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在二年內(nèi)穩(wěn)定。最后經(jīng)國內(nèi)8家資質(zhì)合格的實驗室進行聯(lián)合定值，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.7%，擴展不確定度為0.6%(k=2)。所建立的天麻素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法為從中草藥提取物中制備相關(guān)天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了一種完備的策略，同時該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有助于滿足含有天麻的相關(guān)食品、保健品分析檢測方法校正以及質(zhì)量控制工作需求，為用戶在不同時間、不同空間，使用不同包裝的該種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時所得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性提供保證。