盛 燚，張尚鑫，閆 強，孫若川，李德關(guān)，魯明典，張 震，李永翔

1982年，KIF家族被首次發(fā)現(xiàn)存在于魷魚細胞中，隨后普遍在真核生物中檢出。研究[1]顯示KIF家族是一類具有軸突運輸功能的分子馬達，參與細胞分裂。2005年，首次發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白家族成員20A(kinesin family member 20A, KIF20A)在胰腺癌中高度表達，在體外條件下用siRNA抑制胰腺癌細胞KIF20A的表達后，細胞的增殖被明顯抑制[2]。自此KIF20A在腫瘤中的作用開始倍受關(guān)注。體外研究[3]表明，一些KIF20A衍生肽能夠產(chǎn)生針對KIF20A陽性和HLA-A2陽性胰腺癌細胞的細胞毒T淋巴細胞，從而識別并誘導癌細胞的死亡，而對正常細胞無細胞毒反應，這表明了其在靶向治療上的可能性。不久之后，針對KIF20A在胰腺癌的I/II期臨床試驗更是取得了令人滿意的成果[4-5]。簡而言之，KIF20A可能是一個十分有潛力的腫瘤標志物和治療靶點。然而，KIF20A在癌細胞中的高度表達是否具有普遍性，及其在腫瘤中的生物學功能機制仍然是未知的。該研究通過檢測KIF20A在胃癌中的表達水平，分析其與臨床病理特征和預后的關(guān)系，并調(diào)控其表達探究對胃癌細胞系增殖的影響，為胃癌的臨床預后評估和靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，以及患者知情同意并簽字后，于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸外科收集胃癌患者的手術(shù)后腫瘤樣本。第一批樣本為37對胃癌組織及配對癌旁組織，取樣后加入RNA保存液，之后立刻儲存于-80 ℃冰箱，用qRT-PCR檢測表達。第二批樣本為122例患者術(shù)后胃癌組織和隨機選取的24例癌旁組織，取樣后用福爾馬林浸泡并石蠟包埋，制作成組織微陣列(TMA)，用免疫組化染色檢測表達。人胃癌細胞系AGS來自上海生命科學院，用于細胞增殖實驗。

1.2主要試劑和方法

1.2.1主要試劑 TransZol Up RNA提取試劑盒購自北京Transgen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量試劑盒購自瑞士Roche公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、鼠/兔二抗購自上海碧云天公司；鼠一抗購自美國Abcam公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；超級ECL發(fā)光試劑盒、KIF20A抗體購自美國Thermo Fisher公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素和PBS溶液購自澳大利亞Gibco公司；siRNA-KIF20A購自美國Santa Cruz公司；CellTiter-Glo發(fā)光法細胞活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 按照TransZol試劑盒說明書提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，KIF20A正向引物5′-ACTTTGCGGCTATGCGAGGAT-3′，反向引物5′-TGAGAA GATGCTGTGACTGCG-3′，β-actin正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。qRT-PCR的反應條件包括: 95 ℃ 5 min預變性，然后按95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共做45個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min延伸。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.2.3Western blot實驗 RIPA法提取蛋白后按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度，配制20 μl蛋白量體系。經(jīng)SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，于4 ℃冰箱一抗(KIF20A按1 ∶1 000稀釋，β-actin按1 ∶3 000稀釋)孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗(1 ∶3 000)孵育2 h，再次清洗后使用增強化學發(fā)光法顯影。

1.2.4免疫組化 將組織切片進行HE染色，觀察并取樣典型胃癌組織，制作為組織微陣列。將組織微陣列放入50 ℃烘箱，烘烤2 h，全自動染色機中脫蠟，乙醇脫水，超純水洗滌后檸檬酸抗原修復，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加KIF20A一抗(1 ∶2 000)4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌，滴加兔二抗，孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復染后封片。使用兔血清替代一抗重復實驗作為陰性對照。由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師對組織微陣列進行判讀和評分，染色強度計分：無染色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性細胞數(shù)計分：0%記0分，<25%記1 分，25% ～ 75%記2分，>75%記3分。免疫活性計分(IRS)=染色強度計分×陽性細胞數(shù)計分。IRS≤2記為陰性，將IRS>2記為陽性，從而將所有樣本分為陰性和陽性兩組。

1.2.5細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 AGS細胞系采用混有10%胎牛血清和1%的抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中。待細胞系處于對數(shù)生長期，按照sc-91657說明書進行轉(zhuǎn)染，24 h后提取總RNA和蛋白并進行后續(xù)試驗。

1.2.6細胞活力實驗 成功轉(zhuǎn)染后，待細胞系處于對數(shù)生長期。細胞計數(shù)，制備密度為3×104個/ml的細胞懸液1 ml。分別取100 μl細胞懸液，以3 000個/孔的密度種植于96孔板中。培養(yǎng)72 h后，各孔中加入Cell Titer-Glo試劑20 μl，輕輕混勻后室溫靜置10 min，在多孔板酶標儀上檢測獲取數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學處理使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用配對t檢驗，驗證KIF20A mRNA在胃癌及其癌旁組織中的表達情況。KIF20A表達高低與臨床病理特征的關(guān)系采用Pearson χ2檢驗。采用Kaplan-Meier方法制作生存曲線。采用Log-Rank檢驗進行臨床病理特征及KIF20A表達與總生存期間的單因素分析。采用獨立樣本t檢驗來驗證細胞系增殖的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1KIF20A在胃癌中高表達為了研究胃癌中KIF20A基因表達情況，在37對胃癌及配對癌旁組織中檢測KIF20A mRNA表達，發(fā)現(xiàn)其中27例胃癌患者的KIF20A基因在轉(zhuǎn)錄水平高于其癌旁組織(P<0.05)，見圖1。之后在包含了122例胃癌組織和24例隨機癌旁組織的組織微陣列中進行免疫組化染色，可以發(fā)現(xiàn)KIF20A主要表達于胞質(zhì)中(圖2A)。如圖2B所示，根據(jù)免疫組化評分結(jié)果，胃癌組織中的KIF20A陽性表達(54.92%)明顯高于其癌旁組織(29.17%)(P<0.001)。實驗結(jié)果分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗證了在胃癌中KIF20A表達均是上調(diào)的。

圖1 胃癌及其癌旁組織中KIF20A mRNA的相對表達

2.2KIF20A表達與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)合臨床病理資料，用χ2檢驗來驗證KIF20A基因表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。表1顯示，KIF20A表達與胃癌病理分化有關(guān)(P=0.036)，但KIF20A與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無關(guān)。

表1 胃癌患者中KIF20A表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 胃癌組織及其癌旁正常組織中KIF20A的蛋白表達

A：免疫組化圖；a：KIF20A在胃癌組織中的陽性表達；b：KIF20A在胃癌組織中的陰性表達；c：KIF20A在癌旁正常組織中的陰性表達；1：×100；2：×200；B：免疫組化法檢測胃癌和正常組織KIF20A蛋白表達；與癌旁組織比較：*P<0.05

2.3KIF20A表達與預后的關(guān)系采用Log-Rank檢驗法分析了KIF20A表達與預后之間的關(guān)系。針對KIF20A表達在胃癌中的生存分析顯示，KIF20A高表達的胃癌患者總生存期為(40.16±24.65)月，相較于KIF20A低表達的胃癌患者(48.91±21.84)月明顯偏低(P=0.022)，見圖3。綜上所述，KIF20A可作為胃癌的一個獨立預后風險因子。

2.4KIF20A對AGS細胞增殖能力的影響鑒于KIF20A的高表達可能與胃癌進展有密切關(guān)系，在體外水平探索KIF20A對胃癌細胞增殖能力的影響。利用siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞系，并成功下調(diào)了KIF20A的表達(P=0.005)，見圖4A、4B。采用CellTiter-Glo法檢測AGS細胞系的增殖能力。如圖4C所示，在體外水平，下調(diào)KIF20A基因表達能明顯抑制AGS細胞增殖能力(P<0.001)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線 KIF20A表達與胃癌患者術(shù)后總生存期的關(guān)系

3 討論

作為驅(qū)動蛋白-6亞家族之一，KIF20A是一種微管相關(guān)馬達蛋白，其生物學功能主要參與細胞分裂，以及細胞器或細胞膜的轉(zhuǎn)運等細胞活動[6]。近期有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)KIF20A的上調(diào)與癌癥相關(guān)。2005年，KIF20A被首次發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中過表達，而在體外水平采用siRNA下調(diào)KIF20A基因表達后能抑制胰腺癌細胞的增殖[2]。研究發(fā)現(xiàn)KIF20A在肝癌細胞中過表達，而正常肝細胞中KIF20A幾乎不表達，沉默肝癌細胞中KIF20A基因的表達會導致細胞染色體多倍體化，這種現(xiàn)象與KIF20A能夠促進細胞分裂和增殖但不會誘導細胞凋亡的功能基本一致[7]。更有研究發(fā)現(xiàn)在正常組織中，KIF20A在胎兒肝臟、成人胸腺和骨髓中高表達，在胎盤和成人心臟中低表達，在成人腦、肺、肝、脾、腎、骨骼肌和淋巴中不表達[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)針對KIF20A的衍生肽可以誘導產(chǎn)生對胰腺癌細胞具有免疫殺傷功能的細胞毒T細胞，而對正常細胞幾乎無害[9]。隨之開展的針對KIF20A在胰腺癌的一些I/II期臨床實驗中，也取得了成功。這些研究都說明了KIF20A很可能是癌癥中一個極有潛力的腫瘤治療靶點。但是其潛在的分子機制仍不十分清楚，而且KIF20A與胃癌的關(guān)系也不清楚。

本研究qRT-PCR和免疫組化顯示，相較于正常對照，胃癌中KIF20A在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均高表達，這提示了KIF20A在胃癌中可能扮演著促癌基因的作用。通過組織微陣列結(jié)果，結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，KIF20A高表達與胃癌組織分化程度差顯著相關(guān)。結(jié)合胃癌患者隨訪資料，通過生存分析顯示，KIF20A高表達的胃癌患者總生存期更短。上述結(jié)果提示KIF20A的高表達可能是參與胃癌發(fā)展、遷移等過程的關(guān)鍵基因。在初步體外試驗中，發(fā)現(xiàn)沉默KIF20A的表達后，胃癌細胞的增殖能力受到明顯抑制，這為胃癌靶向治療提供了一個新的可能性。

本實驗依然存在一些不足之處。首先，在生物學功能上，可以進行細胞侵襲和遷移試驗，來驗證癌細胞KIF20A高表達是否能夠增強腫瘤的侵襲和遷移能力。其次，細胞死亡形式包括細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬和有絲分裂災變等。而KIF20A在細胞分裂中占有重要地位，探索KIF20A在上述細胞死亡形式特別是有絲分裂災變過程中是否具有重要作用以及怎樣的作用是我們進一步的研究方向。

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞后對細胞增殖的影響

A：轉(zhuǎn)染siRNA后KIF20A mRNA的表達降低；B：轉(zhuǎn)染siRNA后KIF20A蛋白的表達降低；C：轉(zhuǎn)染siRNA后AGS細胞增殖能力下降；與siRNA-NC組比較：*P<0.05

綜上所述，KIF20A在胃癌中高度表達，也是胃癌中一個獨立預后風險因子。此外，沉默KIF20A抑制了胃癌細胞增殖，提示了KIF20A在胃癌中可能發(fā)揮著癌基因的作用，并很可能是一個新的胃癌治療靶點。進一步研究其潛在分子機制，能夠為胃癌的靶向治療提供新的策略。