楊奉天，王 艷，黃俊凱，李 婉，徐麗紅

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復(fù)發(fā)性的腸道炎癥性疾病，近年因其逐年增高的發(fā)病率而成為消化系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)[1]。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腸黏膜屏障及細(xì)胞屏障功能受損是其發(fā)病的重要機(jī)制之一[2]。溶質(zhì)載體26A3(solute carrie 26A3，SLC26A3)是哺乳類動物腸上皮細(xì)胞頂端膜上主要Cl-/HCO3-離子轉(zhuǎn)運(yùn)體[3]，其功能缺陷所引起的HCO3-分泌減少及Cl-吸收異常可以導(dǎo)致黏膜屏障的穩(wěn)定性下降[4]，已有研究[5]證實(shí)UC患者中存在SLC26A3的表達(dá)缺陷，但其發(fā)生機(jī)制并不清晰。鈉氫交換體調(diào)節(jié)因子4(sodium/proton exchanger regulatory factor 4，NHERF4)是主要表達(dá)在腸道中的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白(PDZ-domain proteins)[6]，既往細(xì)胞學(xué)研究[7]顯示NHERF4可負(fù)性調(diào)控SLC26A3的表達(dá)，NHERF4可能在UC發(fā)展中參與調(diào)控SLC26A3的表達(dá)，但目前尚無文獻(xiàn)證實(shí)NHERF4在UC中的表達(dá)改變。該研究利用惡唑酮(Oxazolone，OXZ)法制備C57BL/6J小鼠結(jié)腸炎動物模型，觀察其遠(yuǎn)端結(jié)腸中SLC26A3和NHERF4 mRNA和蛋白的動態(tài)表達(dá)，初步評估NHERF4/SLC26A3是否參與UC的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 48只雌性SPF級C57BL/6J小鼠由新疆自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。6周齡，體質(zhì)量16～18 g，狀態(tài)優(yōu)良，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑與儀器 OXZ致敏劑(生產(chǎn)編號：MKBS4435V)購自美國Sigma公司；細(xì)胞漿蛋白與細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒購自北京碧云天公司；RIPA總蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司；SLC26A3 Western blot抗體(編號：sc-376187)購自美國Santa公司；NHERF4 Western blot抗體(編號：ab182507)購自美國Abcam公司；β-actin抗體、山羊抗小鼠及山羊抗兔抗體購自北京中杉金橋公司；熒光定量PCR試劑盒購自德國Qiagen 公司；cDNA合成試劑盒、低溫高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；Bio-RAD電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO公司；SLC26A3、NHERF4基因引物設(shè)計(jì)、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1OXZ法建立C57BL/6J小鼠結(jié)腸炎模型 48只C57BL/6J小鼠稱重后按質(zhì)量順序編號，隨機(jī)數(shù)表法分為對照組(n=24)與實(shí)驗(yàn)組(n=24)。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，背部備皮，4% OXZ(100%乙醇溶劑)1 ml溶液涂抹2 d，第7天戊巴比妥鈉麻醉后，直腸灌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的OXZ(50%乙醇溶劑)0.3 ml。對照組小鼠無水乙醇1 ml背部涂抹，直腸灌注50%酒精溶液0.3 ml。保留灌腸30 min后拔出灌腸器。

1.2.2采用UC疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評價(jià)小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度 在造模過程中，每日測量并記錄小鼠體質(zhì)量、糞便含水、大便性狀、大便潛血和血便等指標(biāo)。DAI評分參考Sutherland et al[8]標(biāo)準(zhǔn)：隱血實(shí)驗(yàn)陰性且糞便成形0分；糞便松散不粘附肛門，若隱血陰性1分，陽性2分；糞便液態(tài)且隱血陽性3分；肉眼血便4分。

1.2.3病理組織學(xué)觀察小鼠結(jié)腸黏膜炎癥情況 根據(jù)DAI變化趨勢，選取第6、8、10、14天作為小鼠結(jié)腸炎活動前期、活動期、恢復(fù)期的時(shí)間節(jié)點(diǎn)(該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來源于前期預(yù)實(shí)驗(yàn))，留取組織標(biāo)本。1%戊巴比妥鈉60 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠，取遠(yuǎn)端結(jié)腸1/3(約距肛口1 cm)，剪開結(jié)腸后4 ℃生理鹽水沖洗干凈，4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇水化，蘇木精-伊紅染色，乙醇水化，晾干后封片，行組織病理學(xué)觀察。

1.2.4qRT-PCR 檢測小鼠腸組織SLC26A3與NHERF4的mRNA水平 ① 分別于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第6、8、10、14天，將小鼠麻醉后剖腹，取距肛口1 cm內(nèi)結(jié)腸組織;② 用TRIzol 法提取結(jié)腸組織的總RNA，紫外分光光度計(jì)測量總RNA的濃度與純度，選取吸光度值(optical density，OD) 260 nm/OD280 nm的值在1.8～2.0范圍內(nèi)，按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;③ SLC26A3上游引物序列為：5′-TTCCCCTCAACAACATCACCATCC-3′，下游引物：5′-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3′；NHERF4上游引物序列為：5′-TTCACTCACAACCAACTCACCAG-3′，下游引物：5′-CAGGAACTGTCCAGGGCGAC-3′；β-Actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′;④ 采用熒光定量PCR試劑盒在64孔ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。內(nèi)參基因與目的基因各重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)3個陰性對照，建立總體積為20 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min(1個循環(huán))；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s(40個循環(huán))，循環(huán)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、30 s，60 ℃、15 s后得到溶解曲線。

1.2.5Western blot觀察SLC26A3及NHERF4蛋白的定量表達(dá) 液氮保存標(biāo)本，取出，根據(jù)試劑盒說明書分別提取膜蛋白及總蛋白，測蛋白濃度，5×上樣緩沖液混勻后煮沸8 min使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%牛血清(BSA)洗滌，緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，5% BSA的TBST稀釋SLC26A3(1 ∶100)和NHERF4(1 ∶1 000)抗體，β-actin(1 ∶1 000)作為內(nèi)參，4 ℃過夜。洗膜后5% BSA的TBST稀釋抗兔和抗鼠的二抗(均為1 ∶10 000)37 ℃孵育2 h，洗膜后顯色，暗室內(nèi)膠片曝光。采圖后Gel-pro軟件圖像數(shù)據(jù)分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1小鼠糞便含水量、體質(zhì)量、DAI變化趨勢

2.1.1糞便含水量 小鼠糞便含水量呈現(xiàn)先增高后減少的趨勢。實(shí)驗(yàn)組在第8天糞便含水量明顯增高，第10天達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)組第8天糞便含水量(69.92%±5%)較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)增高(40.47%±6.5%，P<0.05)，在第10天最高(95.56%±2.3%)，對照組第8天的糞便含水量(49.2%±4%)與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)變化不顯著(40.92%±13%，P>0.05)，見圖1。

圖1 小鼠糞便含水量變化

2.1.2小鼠體質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量先升高后減少。實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量于第8天開始明顯下降[(17.65±1.04) g]，較實(shí)驗(yàn)組第7天明顯下降[(18.73±0.7) g，P<0.05]，對照組第8天體質(zhì)量[(16.25±0.5) g]與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)[(16.24±0.4) g，P>0.05]比較，變化不顯著，見圖2。

圖2 小鼠體質(zhì)量變化趨勢

2.1.3小鼠DAI變化趨勢 實(shí)驗(yàn)組在第8天出現(xiàn)大便不成形，且部分出現(xiàn)肉眼血便，其第8天DAI評分(1.26±0.26)較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(0.42±0.21)明顯增高(P<0.05)，且高于同期對照組DAI評分(0.94±0.3，P<0.05)，其第14天DAI評分(2.3±0.8)較第10天 (2.61±0.4)下降，但仍高于對照組第14天的DAI評分(0.2±0.1)，見圖3。即實(shí)驗(yàn)組DAI評分在第8天開始上升，第10天達(dá)到峰值，第14天下降，呈先上升后降低趨勢。

圖3 小鼠DAI變化趨勢

2.2結(jié)腸黏膜組織學(xué)觀察結(jié)腸黏膜大體組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組第8天出現(xiàn)遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜紅腫、充血，部分結(jié)腸黏膜表面可見膿苔附著，并有潰瘍形成，病變以中遠(yuǎn)段結(jié)腸為主，同期對照組遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜僅輕微水腫，無糜爛，無潰瘍形成。結(jié)腸黏膜顯微鏡下病理組織學(xué)觀察：對照組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸黏膜無異常炎性細(xì)胞浸潤；實(shí)驗(yàn)組第6天結(jié)腸黏膜與對照組相似，實(shí)驗(yàn)組第8天及第10天結(jié)腸黏膜可見上皮細(xì)胞脫落，正常杯狀細(xì)胞減少、萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤，可見隱窩膿腫，炎癥局限于黏膜和黏膜下層，實(shí)驗(yàn)組第14天結(jié)腸黏膜未見明顯腸上皮細(xì)胞缺失，正常杯狀細(xì)胞較前增多，炎細(xì)胞減少，見圖4，箭頭所指為隱窩內(nèi)膿腫。提示實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)改變與人UC結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)改變相似。

2.3小鼠腸道組織的SLC26A3mRNA表達(dá)水平與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道組織的SLC26A3 mRNA的表達(dá)降低，且實(shí)驗(yàn)組第8 、10天表達(dá)均低于同期對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠腸道組織NHERF4 mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組第8天表達(dá)高于同期對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4SLC26A3與NHERF4的蛋白表達(dá)Western blot檢測SLC26A3蛋白定量表達(dá)的結(jié)果顯示，與同期對照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸黏膜中SLC26A3的表達(dá)均降低，其中以第10天差異最為顯著(對照組第10天vs實(shí)驗(yàn)組第10天：0.83±0.05vs0.13±0.01，P<0.05)；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組炎癥進(jìn)展、恢復(fù)過程中，以第10天 SLC26A3表達(dá)水平最低(第10天vs第6天：0.13±0.01vs0.76±0.03，P<0.05；第10天vs第14天：0.13±0.01vs0.31±0.04，P<0.05)，見圖5，即小鼠腸黏膜中SLC26A3表達(dá)在炎癥活動期降低的更為明顯。Western blot檢測NHERF4蛋白定量表達(dá)的結(jié)果顯示，與同期對照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸黏膜中NHERF4的表達(dá)明顯增高，其中以第8天差異最為顯著(對照組第8天vs實(shí)驗(yàn)組第8天：0.23±0.004vs0.56±0.02，P<0.05)；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組炎癥進(jìn)展、恢復(fù)過程中，以第8天的表達(dá)水平最高(第8天vs第6天：0.56±0.02vs0.32±0.02，P<0.05；第8天vs第14天：0.56±0.02vs0.34±0.02，P<0.05)，見圖5，提示在活動期結(jié)腸黏膜中NHERF4的表達(dá)明顯上升。盡管實(shí)驗(yàn)組第14天結(jié)腸黏膜中NHERF4的表達(dá)水平開始下降，但與同期對照組比較，其表達(dá)水平仍明顯增高(實(shí)驗(yàn)組第14天vs對照組第14天：0.34±0.02vs0.20±0.02，P<0.05)，這可能與腸道黏膜細(xì)胞功能尚未完全恢復(fù)有關(guān)。

2.5NHERF4、SLC26A3與DAI在疾病發(fā)展過程中的相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)組DAI評分先增高后降低，在第10天出現(xiàn)峰值，隨后進(jìn)入炎癥減輕階段，直至第14天DAI評分呈逐漸下降趨勢，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組腸黏膜中SLC26A3的降低與DAI評分的升高同步出現(xiàn)，并維持至DAI評分最高時(shí)，在后期DAI評分逐漸降低時(shí)，其表達(dá)呈緩慢上升趨勢，即SLC26A3的表達(dá)與DAI評分呈相反的趨勢，呈先降低后增高。NHERF4的表達(dá)與DAI評分呈相似的趨勢，先增高后降低，但在DAI評分開始上升時(shí)NHERF4表達(dá)處于峰值，而后期DAI評分最高時(shí)，NHERF4表達(dá)呈逐漸下降趨勢。本組結(jié)果提示，在腸道炎癥的進(jìn)展恢復(fù)過程中始終伴隨著SLC26A3和NHERF4的表達(dá)改變，且NHERF4的表達(dá)升高可能先于腸道炎癥癥狀的出現(xiàn)。見圖6。

圖4 小鼠結(jié)腸炎模型HE染色 ×400

A：實(shí)驗(yàn)組6 d；B：實(shí)驗(yàn)組8 d；C：實(shí)驗(yàn)組10 d；D：實(shí)驗(yàn)組14 d；E：對照組6 d；F：對照組8 d；G：對照組10 d；H：對照組14 d

表1 腸道組織SLC26A3 mRNA、NHERF4 mRNA水平比較

與對照組比較：*P<0.05

圖5 動物模型實(shí)驗(yàn)SLC26A3/NHERF4的表達(dá)

A：實(shí)驗(yàn)組6 d；B：實(shí)驗(yàn)組8 d；C：實(shí)驗(yàn)組10 d；D：實(shí)驗(yàn)組14 d; E：對照組6 d；F：對照組8 d；G：對照組10 d；H：對照組14 d

3 討論

UC是一種以結(jié)腸黏膜層和黏膜下層損傷為主的慢性炎癥性腸道疾病[9]，腸黏膜屏障功能缺陷及腸上皮細(xì)胞屏障功能減退在UC發(fā)病中具有重要作用[2,10-11]。

既往研究[12-13]顯示，SLC26A3是在腸道豐富表達(dá)的Cl-/HCO3-交換體。腸黏膜化學(xué)屏障是一種主要由黏蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀膠體，分泌型黏蛋白2(mucin 2, MUC2)是其主要成分[4]。相關(guān)報(bào)道顯示，UC中存在SLC26A3的表達(dá)異常，其功能缺陷可引起MUC2表達(dá)異常，繼而導(dǎo)致屏障穩(wěn)定性的下降及腸黏膜屏障功能的減退[4]，使腸道菌群得以與腸上皮細(xì)胞密切接觸[2]，引起腸道炎癥的發(fā)生，即SLC26A3的功能缺陷與UC的疾病發(fā)展密切相關(guān)。本研究與既往文獻(xiàn)[5]的研究結(jié)果相似，在腸道炎癥進(jìn)展過程當(dāng)中，SLC26A3確實(shí)存在有表達(dá)缺陷，但本研究還表明，SLC26A3在腸道炎癥活動期的表達(dá)低于疾病前期、恢復(fù)期及正常小鼠SLC26A3的表達(dá)，具體表現(xiàn)為SLC26A3的表達(dá)與小鼠腸道炎癥程度、腹瀉等變化一致，提示在腸道炎癥進(jìn)展過程中SLC26A3表達(dá)的改變不僅與炎癥活動度有關(guān)，還與腹瀉癥狀有關(guān)；并且黏膜屏障損傷與UC患者腸黏膜恢復(fù)后臨床癥狀持續(xù)存在有關(guān)[14]，SLC26A3的正常表達(dá)與腸黏膜屏障相關(guān)[4]，從而推測SLC26A3表達(dá)的異常可能與UC患者腸黏膜恢復(fù)后臨床癥狀持續(xù)存在具有一定相關(guān)性，但這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證分析。

圖6 SLC26A3、NHERF4蛋白表達(dá)趨勢與DAI評分趨勢

A：實(shí)驗(yàn)組6 d；B：實(shí)驗(yàn)組8 d；C：實(shí)驗(yàn)組10 d；D：實(shí)驗(yàn)組14 d

鈉氫交換體調(diào)節(jié)因子(sodium/proton exchanger regulatory factor，NHERF)蛋白家族是在上皮細(xì)胞中豐富表達(dá)的PDZ結(jié)構(gòu)蛋白[15]，其亞型NHERF4可與胃腸上皮的多種轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用，尤與SLC26A3的結(jié)合最強(qiáng)，并負(fù)性調(diào)控SLC26A3在細(xì)胞膜處的表達(dá)[6-7]，在UC發(fā)展過程中，SLC26A3的降低與NHERF4的表達(dá)可能具有相關(guān)性，但未見NHERF4在UC中表達(dá)的相關(guān)研究。本研究結(jié)果首次證實(shí)，在結(jié)腸炎模型小鼠處于疾病活動期時(shí)確實(shí)存在腸黏膜中NHERF4的表達(dá)明顯增高。此外，本研究結(jié)果還顯示，NHERF4的表達(dá)升高可能先于腸道炎癥癥狀的出現(xiàn)，并隨炎癥恢復(fù)其表達(dá)水平呈略落后的逐漸降低，提示NHERF4可能可作為判斷UC發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)。同時(shí)，通過比較分析NHERF4、SLC26A3和DAI在疾病發(fā)展過程中的相關(guān)性，本研究結(jié)果顯示，在腸道炎癥發(fā)展過程中，SLC26A3的表達(dá)降低與NHERF4的表達(dá)增高是相伴隨而存在的，且NHERF4與SLC26A3的降低增高在時(shí)間點(diǎn)上具有一定的重合性， UC中可能存在NHERF4對SLC26A3表達(dá)的負(fù)向調(diào)控，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步研究UC發(fā)展過程中SLC26A3表達(dá)改變的機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和新的思路，同時(shí)，若本研究結(jié)果能夠得到進(jìn)一步證實(shí)，還可為UC的治療提供新的靶點(diǎn)，如通過使用下調(diào)NHERF4或阻斷NHERF4與SLC26A3結(jié)合的藥物來改善腸黏膜中SLC26A3的表達(dá)，為減輕UC患者臨床癥狀和復(fù)發(fā)提供新的治療方案。