李 戀，沈曉玲，張明昱, 包麗麗，納仁高娃

呼吸鏈由4個功能相對獨(dú)立的蛋白復(fù)合物組成，復(fù)合物Ⅰ是電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈上最大、最復(fù)雜的酶。真核生物中，復(fù)合物Ⅰ由45個不同的蛋白亞基構(gòu)成，其中僅7個蛋白由線粒體基因編碼，包括重要亞基ND5，其余由核基因編碼[1]。線粒體基因無組蛋白保護(hù),易受到環(huán)境中高濃度氧化物損傷而突變，有研究[2-3]證明線粒體突變會降低NADH脫氫酶活性，使細(xì)胞供能失衡引起疾病。線粒體突變與MELAS綜合征[4]、帕金森病[5]、腫瘤[6]等有關(guān)，甚至與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[7]。細(xì)菌[8]、哺乳動物[9-10]復(fù)合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)已解析，但人細(xì)胞中復(fù)合物Ⅰ的重要亞基ND5結(jié)構(gòu)及功能沒有詳細(xì)報(bào)道。該研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測、比較分析正常細(xì)胞和BGC823中ND5差異, 為深入探究ND5基因突變與胃癌關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料通過基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取得到的BGC823總DNA。

1.2方法

1.2.1PCR反應(yīng)并測序 設(shè)計(jì)兩對引物擴(kuò)增ND5(1-2)、ND5(3-4)兩個片段，擴(kuò)增體系(50 μl)：DNA模板100 ng，dNTP(2.5 mmol/L)3 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，10×Buffer 5 μl，Taq酶0.5 μl，超純水補(bǔ)足體積至50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入熱循環(huán)：94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)。

表1 擴(kuò)增ND5基因引物表

PCR產(chǎn)物ND5(1-2)、ND5(3-4)兩個片段在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測條帶特異性并切膠純化后由奧科生物技術(shù)公司和華大基因測序。

1.2.2生物信息學(xué)比較分析 ProtParam用于分析ND5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用EASE-MM分析穩(wěn)定性；采用ProtScale 、TMHMM預(yù)測蛋白質(zhì)的親/疏水性和跨膜區(qū)；借助PredictProtien和Swiss-Model在線預(yù)測軟件對蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，用Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件分析點(diǎn)突變對ND5三級結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果

2.1胃癌細(xì)胞BGC823中ND5基因突變情況用引物ND5(1-2)、ND5(3-4)PCR擴(kuò)增、測序后拼接可以獲得ND5基因全長。以修正劍橋參考序列(rCRS:NC.012920)為對照，rCRS作為正常細(xì)胞線粒體ND5基因，分析比較獲得BGC823細(xì)胞的ND5基因，將該細(xì)胞中與rCRS序列有差異的位點(diǎn)見表2。經(jīng)分析氨基酸改變情況，BGC823細(xì)胞中在12835、13105位點(diǎn)處發(fā)生了錯義突變。

表2 BGC823細(xì)胞中ND5基因突變位點(diǎn)

注：G-A 代表rCRS該位點(diǎn)堿基G，但BGC823細(xì)胞中為A；G-G/A 代表rCRS該位點(diǎn)堿基G，但BGC823細(xì)胞中同時(shí)存在G和A

2.2人ND5蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測和分析借助ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測網(wǎng)站對正常人ND5蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，并與發(fā)生異質(zhì)性點(diǎn)突變的BGC823細(xì)胞中ND5蛋白進(jìn)行比對。人線粒體ND5基因編碼603個氨基酸；相對分子質(zhì)量為67 026.51；人線粒體ND5蛋白等電點(diǎn)為9.14，說明ND5是堿性蛋白質(zhì)；哺乳動物ND5蛋白的半衰期達(dá)到了30 h，ND5蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)33.95，小于40，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。同時(shí)，平均疏水性預(yù)測結(jié)果顯示：0.589，表明是疏水蛋白質(zhì)。以上特點(diǎn)符合已報(bào)道的ND5蛋白的特性。對BGC823的ND5蛋白序列進(jìn)行預(yù)測，顯示相對分子質(zhì)量為67 042.51；等電點(diǎn)相同；平均疏水性預(yù)測結(jié)果為0.584，說明點(diǎn)突變并未改變蛋白疏水性；ND5蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為34.9，雖然也低于40，但比正常ND5蛋白值稍高，說明突變降低蛋白穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過EASE-MM(http://sparks-lab.org/server/ease)在線預(yù)測12835和13105兩處位點(diǎn)發(fā)生的突變對ND5蛋白穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示兩位的氨基酸的改變均很可能降低了該蛋白的穩(wěn)定性。

2.3預(yù)測與分析突變對ND5蛋白親水性/疏水性和跨膜區(qū)的影響使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測的工具，對人ND5蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析， 結(jié)果如圖1所示。ND5蛋白親水性的最強(qiáng)位點(diǎn)是29位的賴氨酸(Lysine，K)，分值為-2.622；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是257位的異亮氨酸(iosleucine，I)，分值為3.244。BGC823細(xì)胞中的ND5蛋白親水性的最強(qiáng)位點(diǎn)未改變，但疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)變?yōu)?26位的異亮氨酸(iosleucine，I)、127位的蘇氨酸(threonine，T)、257位的異亮氨酸(iosleucine，I)，分值均為3.211。最強(qiáng)疏水位點(diǎn)的增多可能改變蛋白表面的結(jié)合位點(diǎn)及疏水肽段分布。ProtScale預(yù)測結(jié)果見圖1，提示人ND5蛋白疏水肽鏈與親水肽鏈相間分布在整個氨基酸序列中，結(jié)合ProtParam 的預(yù)測結(jié)果，顯示ND5蛋白是疏水蛋白質(zhì)。

圖1 ND5蛋白的親水性/疏水性分析A：正常ND5蛋白結(jié)果；B：BGC823中ND5蛋白結(jié)果

利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件對人ND5蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果提示該蛋白為多次跨膜蛋白質(zhì)，該結(jié)果與ProtScale軟件預(yù)測結(jié)果一致。TMHMM預(yù)測ND5蛋白螺旋分別在35～57、85～107、120～137、141～160、172～191、211～233、245～267、272～294、301～320、325～347、368～387、407～429、450～472、482～504和583～602氨基酸之間，N 端在胞內(nèi)、C端在細(xì)胞外，見圖2。BGC823中ND5蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果與正常人ND5蛋白分析結(jié)果一致，說明該軟件分析顯示突變可能并未影響跨膜區(qū)的肽段分布，進(jìn)一步在二級結(jié)構(gòu)中使用其他軟件進(jìn)行分析，以相互驗(yàn)證。

2.4人ND5蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析通過PredictProtien(https://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測ND5蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3A。該蛋白含有17個跨膜螺旋區(qū)和2個β-折疊區(qū)，螺旋區(qū)和β-折疊區(qū)的氨基酸比率分別為73.47%和2.65%，LOOP區(qū)氨基酸比率為23.88%，說明人ND5蛋白近3/4的氨基酸為螺旋結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示91.71%的氨基酸殘基是疏水的，6.3%的氨基酸殘基是親水的，1.99%的氨基酸殘基介于兩者之間。

圖2 ND5蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測

BGC823中ND5蛋白的螺旋區(qū)與正常ND5蛋白有差別，見圖3B，在243～349位點(diǎn)區(qū)正常ND5蛋白形成三個螺旋區(qū)(243～268、270～319、320～349)，BGC823的ND5蛋白形成兩個螺旋區(qū)(243～319、321～348)；在381～389位點(diǎn)區(qū)BGC823的ND5蛋白預(yù)測結(jié)果中多出一個螺旋(385～386)；在389～431位點(diǎn)區(qū)BGC823的ND5蛋白預(yù)測分為兩段螺旋(389～402、404～431)；在529～580位點(diǎn)區(qū)BGC823的ND5蛋白預(yù)測分為三段螺旋(529～540、542～561、563～580)。兩者在跨膜螺旋區(qū)預(yù)測結(jié)果也有差異，BGC823中ND5蛋白在536～573位點(diǎn)區(qū)有兩段跨膜螺旋(536～553、557～573)，而正常ND5蛋白僅有一段跨膜螺旋(548～563)。同時(shí)，預(yù)測結(jié)果顯示，蛋白結(jié)合位點(diǎn)兩者有差別，BGC823的ND5蛋白比正常ND5蛋白預(yù)測結(jié)果中在438位點(diǎn)和575位點(diǎn)均多了一個蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而在535位點(diǎn)少了一個蛋白結(jié)合位點(diǎn)。BGC823中ND5的螺旋區(qū)、β-折疊區(qū)和LOOP區(qū)的氨基酸比率沒有變化，但疏水氨基酸殘基比率降為91.04%，親水氨基酸殘基比率升高為6.47%，介于疏水和親水性之間的氨基酸殘基的比率為2.4%?？梢夿GC823中兩處氨基酸位點(diǎn)的改變影響了疏水肽段和蛋白結(jié)合位點(diǎn)的分布，對ND5蛋白二級結(jié)構(gòu)有一定影響。

2.5人ND5蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析Swiss-Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)可利用同源建模的方法對一段未知的蛋白三級結(jié)構(gòu)作預(yù)測。將人ND5蛋白序列輸入該在線預(yù)測平臺后，會自動選擇與輸入序列同源性最高的已知序列結(jié)構(gòu)為建模主要參照結(jié)構(gòu)，見圖4A，其中一個已知結(jié)構(gòu)序列(SMTL ID：5xtc.1)同源性高達(dá)99.5%，此序列是由Guo et al[11]完成結(jié)構(gòu)分析，他們研究組對人類電子傳遞鏈上的復(fù)合物Ⅰ結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。人ND5蛋白構(gòu)建模型的GMQE(全球模型質(zhì)量評估)分?jǐn)?shù)為0.98,接近1,說明預(yù)測可靠性高。進(jìn)一步分析人ND5蛋白的氨基酸序列與模型蛋白質(zhì)相似性波形圖，見圖4B, 預(yù)測結(jié)構(gòu)的波形較穩(wěn)定且絕大部分的氨基酸殘基分值不低于0.6, 說明模型較趨近于真實(shí)情況。

為了進(jìn)一步預(yù)測BGC823中具有兩處氨基酸改變位點(diǎn)的ND5蛋白三級結(jié)構(gòu)是否有改變，使用 Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件進(jìn)行分析。BGC823中ND5蛋白167位的丙氨酸(alanine，A)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(threonine，T),疏水氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水氨基酸,257位的異亮氨酸(Isoleucine，I)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Valine，V)，將人ND5蛋白模型的167、257位點(diǎn)進(jìn)行突變，正常ND5蛋白167位與171、163位分別形成氫鍵，BGC823中ND5蛋白167位與171、163和164位分別形成氫鍵，結(jié)果顯示167位點(diǎn)突變使新的氫鍵形成，見圖5。

圖3 人ND5蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析A：正常ND5二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果；B：BGC823中ND5二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

圖4 ND5蛋白三級結(jié)構(gòu)及其同源蛋白質(zhì)相似性波形圖A：人ND5蛋白預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)；B：ND5同源蛋白質(zhì)相似性波形圖

圖5 人ND5三級結(jié)構(gòu)及突變前后167位氫鍵改變

A：ND5蛋白三級結(jié)構(gòu)；B1：正常ND5蛋白167位點(diǎn)處氫鍵情況；B2：突變ND5蛋白167位點(diǎn)處氫鍵情況;圓圈為突變位點(diǎn)在ND5三級結(jié)構(gòu)中的位置；黃色箭頭指向突變前后一致的化學(xué)鍵；紅色箭頭指向突變后出現(xiàn)的新化學(xué)鍵

3 討論

ND5基因位于線粒體染色體上，其編碼蛋白是組成復(fù)合物Ⅰ的重要亞單位。復(fù)合物I由跨膜臂和伸入線粒體基質(zhì)的親水臂兩部分組成，親水臂和跨膜臂連接呈L形。ND5位于跨膜臂上，是構(gòu)成反向運(yùn)轉(zhuǎn)樣質(zhì)子泵模式的核心亞基。復(fù)合物I的跨膜臂與親水臂連接，另一端與復(fù)合物IV結(jié)合，主要通過ND5與復(fù)合物IV中的COX7C蛋白亞基相互作用[10]。

本研究檢測胃癌細(xì)胞系中BGC823的ND5基因點(diǎn)突變情況，發(fā)現(xiàn)在12835和13105位點(diǎn)的突變會引起其翻譯蛋白在167和254位點(diǎn)的錯義突變。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析比較了正常ND5蛋白與BGC823中出現(xiàn)錯義突變的ND5蛋白在理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)的差異。經(jīng)ProtParam 和EASE-MM生物信息在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)BGC823中ND5基因的兩處突變很可能引起其蛋白穩(wěn)定性下降。雖然突變前后等電點(diǎn)均為9.14，但經(jīng)ProtScale軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)突變后的ND5蛋白最強(qiáng)疏水位點(diǎn)在蛋白序列126、127位點(diǎn)增加兩處。PredictProtien軟件預(yù)測結(jié)果顯示突變后的ND5蛋白二級結(jié)構(gòu)中螺旋區(qū)分布與正常蛋白有差別且蛋白結(jié)合位點(diǎn)增加，這些改變很可能影響蛋白高級結(jié)構(gòu)形成及蛋白活性。經(jīng)Swiss-Pdb Viewer Manual v3.7軟件預(yù)測在蛋白167位點(diǎn)突變后形成了新的氫鍵。兩處突變造成ND5蛋白的物理性狀和結(jié)構(gòu)的改變，很可能影響該蛋白正常生物學(xué)功能。ND5基因突變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的相關(guān)性已在不斷被證實(shí)。已有相關(guān)研究報(bào)道ND5基因突變在多種腫瘤組織中被檢測到，與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Chattopadhyay et al[12]在口腔癌患者中檢測ND5基因，找到的5處點(diǎn)突變和7處SNP與腫瘤生長有關(guān)。Li et al[13]建議將ND5基因13273位堿基缺失作為患乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)檢測的生物標(biāo)記。Kabekkodu et al[14]發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ND5基因的突變位點(diǎn)數(shù)較多，僅次于D-Loop基因。Li et al[15]高通量測序檢測乳腺癌患者血液中的線粒體基因突變，其中包括ND5基因在內(nèi)的一些線粒體基因突變可能被用作乳腺癌診斷的潛在標(biāo)志物。

根據(jù)本研究結(jié)果，從發(fā)生機(jī)制上推測，很可能是由于ND5基因突變引起ND5蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而進(jìn)一步影響復(fù)合物Ⅰ的活性，甚至可能影響與其他復(fù)合物結(jié)合活性，最終引起細(xì)胞的能量代謝失衡，而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或預(yù)后不良等問題。