李 新 ，牛 冰 ，李慶輝 ，張成娟

Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子8(KLF8)是Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel like transcription factor，KLFs)家族成員之一，是表達(dá)廣泛的一個(gè)Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)形成等多種生物學(xué)過程[1]，研究[2-3]顯示，包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中KLF8呈現(xiàn)出過表達(dá)，而抑制KLF8后可降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，提示抑制乳腺癌中KLF8的表達(dá)可能影響其發(fā)生發(fā)展，但目前研究尚不清楚。

姜黃素(Curcumin)是姜黃的根莖中提取出來的一種酚性色素，具有明顯的抗腫瘤作用，有研究[4]顯示，姜黃素可明顯抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡。抑制KLF8基因表達(dá)與姜黃素聯(lián)合用于乳腺癌是否產(chǎn)生協(xié)同治療作用尚不清楚。因此，該研究通過RNA干擾抑制KLF8基因表達(dá)及姜黃素單獨(dú)或共同處理乳腺癌細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)癌細(xì)胞活力和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究對(duì)其生物學(xué)特性影響的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器小牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；姜黃素購自美國(guó)Sigma公司；AG490購自美國(guó)Biosource公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海碧云天公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司；KLF8、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(phosphorylated Janus kinase2，p-JAK2)、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體購自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀及流式細(xì)胞儀均購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞及其培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；MCF-7細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞在含有小牛血清及雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中， 5% CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化后收集細(xì)胞，接種細(xì)胞于6孔板，轉(zhuǎn)染前1 d更換培養(yǎng)液(含有血清，不含抗生素)，待細(xì)胞達(dá)70%～90%的生長(zhǎng)密度時(shí)通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將合成的干擾KLF8表達(dá)的siRNA(KLF8-siRNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA作為陰性對(duì)照組，并設(shè)置只加入脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格參照試劑盒說明，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA的MCF-7細(xì)胞KLF8的表達(dá)通過Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA的MCF-7細(xì)胞KLF8的表達(dá)。簡(jiǎn)要步驟如下：PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，離心后棄掉上清，加入全細(xì)胞蛋白裂解液于冰上反應(yīng)30 min，離心收集上清液，上清液即為細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，蛋白經(jīng)100 ℃變性，取等量變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后切下含有目的蛋白的膠通過電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，封閉后置入適當(dāng)比例的KLF8和GAPDH一抗溶液中，4 ℃緩慢搖動(dòng)過夜，洗膜，加入二抗，室溫反應(yīng)2 h，ECL發(fā)光后暗室中將X光片曝光，沖洗X光片，拍照掃描，成像分析軟件分析KLF8的相對(duì)表達(dá)量。

1.5CCK-8法檢測(cè)姜黃素聯(lián)合KLF8基因siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響以每孔100 μl(約1×104個(gè)細(xì)胞)接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞于96孔板，用于調(diào)零組細(xì)胞的僅僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)滿50%～80%孔底時(shí)參照上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA)、KLF8-siRNA(轉(zhuǎn)染合成的干擾KLF8表達(dá)的siRNA)、姜黃素組(40 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞)和KLF8-siRNA+姜黃素組(在轉(zhuǎn)染KLF8-siRNA的基礎(chǔ)上加入姜黃素)，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，加入10 μl CCK-8試劑至每孔中，利用調(diào)零組調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(optical density，OD)，以O(shè)D值反映細(xì)胞活力，可以間接反映出細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜黃素聯(lián)合KLF8基因siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響分組及處理方法同1.5，PBS洗滌各組細(xì)胞，Binding緩沖液重懸細(xì)胞，利用Annexin V-FITC和PI熒光染色，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7姜黃素聯(lián)合KLF8基因siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞活力及凋亡的影響AG490作為JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑，加入濃度為20 μmol/L，通過CCK-8法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)用KLF8-siRNA+姜黃素+AG490處理細(xì)胞相對(duì)于KLF8-siRNA+姜黃素處理的細(xì)胞活力及凋亡率情況，Western blot檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達(dá)，方法同1.4。

2 結(jié)果

2.1KLF8-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后KLF8的表達(dá)KLF8-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后KLF8的表達(dá)結(jié)果見圖1。與空白對(duì)照組(0.311±0.035)比較，KLF8-siRNA組(0.102±0.010)KLF8的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而陰性對(duì)照組(0.302±0.032)和空白對(duì)照組KLF8的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 KLF8-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后KLF8的表達(dá)

2.2姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：KLF8-siRNA組(0.562±0.048)和姜黃素組(0.626±0.052)的細(xì)胞活力均顯著低于陰性對(duì)照組(0.873±0.074)(P<0.05)，高于KLF8-siRNA+姜黃素組(0.385±0.041)(P<0.05)。

2.3姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：KLF8-siRNA組(12.12±1.02)%和姜黃素組(10.77±0.96)%的細(xì)胞凋亡率均顯著高于陰性對(duì)照組(1.56±0.16)%(P<0.05)，低于KLF8-siRNA+姜黃素組(18.79±1.35)%(P<0.05)。見圖2。

2.4姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：KLF8-siRNA組和姜黃素組Cyclin D1、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá)均顯著低于陰性對(duì)照組(KLF8-siRNA組：P<0.05；姜黃素組：P<0.05)，高于KLF8-siRNA+姜黃素組(KLF8-siRNA組：P<0.05；姜黃素組P<0.05)。四組間JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖3。

2.5姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)對(duì)MCF-7細(xì)胞活力及凋亡的影響姜黃素、KLF8-siRNA及JAK2/STAT3信號(hào)抑制劑AG490共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞OD值及凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示：與KLF8-siRNA+姜黃素組[(0.422±0.043)、(16.68±1.21)%]比較，KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組OD值(0.301±0.032)顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高[(21.15±1.54)%](P<0.05)。見圖4。

表1 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05；與KLF8-siRNA+姜黃素組比較：#P<0.05

圖2 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

圖3 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)的影響

A：陰性對(duì)照組；B：KLF8-siRNA組；C：姜黃素組；D：KLF8-siRNA+姜黃素組

2.6姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1和Bcl-2表達(dá)的影響姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)后MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達(dá)結(jié)果見表2、圖5。與KLF8-siRNA+姜黃素組比較，KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

表2 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)的影響

與KLF8-siRNA+姜黃素組比較：*P<0.05

圖4 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)對(duì)MCF-7細(xì)胞活力及凋亡的影響

圖5 姜黃素聯(lián)合KLF8-siRNA抑制JAK2/STAT3信號(hào)對(duì)MCF-7細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)的影響

A：KLF8-siRNA+姜黃素組；B：KLF8-siRNA+姜黃素+AG490組

3 討論

研究[5]顯示，在多種腫瘤中，KLFs家族的多個(gè)成員與癌基因相關(guān)。KLF8是KLFs家族成員之一，在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial cell mesenchyme transformation，EMT)、細(xì)胞致癌性分化、細(xì)胞侵襲和遷移、周期循環(huán)等過程中均有重要作用，且在多種腫瘤中過表達(dá)，其過表達(dá)與疾病不良預(yù)后及發(fā)生相關(guān)[6]。也有研究[7]指出抑制KLF8的表達(dá)可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如抑制腎癌細(xì)胞KLF8表達(dá)可降低癌細(xì)胞增殖、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。KLF8在乳腺癌中的研究相對(duì)較少，研究[8]顯示，KLF8在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，可通過活化基質(zhì)金屬蛋白9促進(jìn)乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究旨在抑制KLF8對(duì)乳腺癌增殖凋亡的影響。我國(guó)中藥資源豐富，中藥提取物在腫瘤治療的研究受到廣泛關(guān)注，姜黃素是姜黃的根莖中提取出來的一種酚性色素，目前在腫瘤中的作用有大量研究，研究[9]顯示，姜黃素可降低乳腺癌的增殖、侵襲、遷移，阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但聯(lián)合使用姜黃素和KLF8的siRNA是否能更有效地治療乳腺癌還未清楚。

鑒于有研究[2]已證實(shí)乳腺癌中KLF8存在高表達(dá)，本研究檢測(cè)抑制KLF8表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響。由于RNA干擾技術(shù)能在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平及染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，且表現(xiàn)出很強(qiáng)的序列特異性、有效性，在多種腫瘤中研究基因功能時(shí)被應(yīng)用[10]，因此本研究也選用RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌中KLF8的表達(dá)。將KLF8的siRNA和姜黃素共同處理乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示KLF8-siRNA和姜黃素均能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這提示KLF8基因和姜黃素能協(xié)同用于乳腺癌的防治。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是STATs家族的一員，與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性密切相關(guān)，在多種腫瘤中出現(xiàn)異?；罨琒TAT3的異?；罨梢鸺?xì)胞異常增殖分化，且凋亡受到抑制，目前已被確認(rèn)為癌基因，STAT3引起癌變的機(jī)制主要是通過激活CyclinD1、Bcl-2、Survivin等靶基因的一些產(chǎn)物表達(dá)實(shí)現(xiàn)[11]。CyclinD1是一個(gè)細(xì)胞周期核因子，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖[12]。Bcl-2是Bcl-2家族成員之一，抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13]。JAK2處在STAT3上游，JAK2激酶抑制劑AG490可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，從而使細(xì)胞增殖受到抑制，AG490可抑制包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究顯示，姜黃素和KLF8的siRNA均能下調(diào)p-JAK2和p-STAT3及靶基因CyclinD1和Bcl-2表達(dá)，兩者聯(lián)合下調(diào)更明顯，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路后，相對(duì)于聯(lián)合使用姜黃素和KLF8的siRNA對(duì)細(xì)胞的抑制作用和凋亡促進(jìn)作用更明顯。

綜上所述，下調(diào)KLF8基因表達(dá)和姜黃素均能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路降低乳腺癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞活力及凋亡的影響作用更強(qiáng)。該研究可能為乳腺癌的治療提供了新的途徑，值得進(jìn)一步深入探討。