韓敦富，尹荷珊，王 延，王鵬云，汪 震，魏 超，時(shí) 明

炎癥因子特別是IL-1β在椎間盤退變過程中發(fā)揮了很大的促進(jìn)作用，涉及到諸多方面[1-2]。最近的研究[3]表明，IL-1β不僅能夠?qū)е聽I養(yǎng)缺乏狀態(tài)下椎間盤細(xì)胞的凋亡，而且還可以大大提高椎間盤細(xì)胞對Fas Ligand介導(dǎo)的凋亡敏感性[4]。Cui et al[4]研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以上調(diào)死亡受體Fas mRNA 的表達(dá)。然而，關(guān)于IL-1β預(yù)刺激增強(qiáng)了椎間盤細(xì)胞對Fas L的凋亡敏感性的原因卻未作深究。

該研究力圖利用RNAi的方法對這一原因進(jìn)行探討并檢驗(yàn)?zāi)芊窭眠@一技術(shù)降低椎間盤細(xì)胞對炎性因子刺激而導(dǎo)致的凋亡敏感性，并對其機(jī)制作初步探討。為保持與Cui et al[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，本部分實(shí)驗(yàn)仍然采用了SD大鼠椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+髓核交界區(qū)細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物3月齡SD大鼠，雌雄不限(中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.2主要試劑及儀器DMEM-F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；特優(yōu)級胎牛血清(美國Hyclone公司)；重組大鼠Fas Ligand(美國R&D Systems公司)；Fas-siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司)；RT-PCR試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit，日本TaKaRa公司，)；PCR 引物(上海生工生物工程公司)；β-actin單克隆抗體、Fas單克隆抗體 (anti-Rat)、蛋白 Marker(美國Newmarker公司)；碘化丙啶、Annexin V-FITC (奧地利Bender MedSystems公司)；流式細(xì)胞儀(EpicsALtra，美國Beckman CouLter公司)。

1.3SD大鼠椎間盤細(xì)胞分離和培養(yǎng)按Cui et al[4]培養(yǎng)方法，10%水合氯醛麻醉SD大鼠，取L3-L6 椎間盤，顯微鏡下分離取出內(nèi)層纖維環(huán) +髓核交界區(qū)組織，PBS緩沖液沖洗、切碎、轉(zhuǎn)移、胰蛋白酶消化、過濾、離心，最后以1×106/ml 在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鑒定結(jié)果見圖1。

1.4細(xì)胞準(zhǔn)備和siRNA轉(zhuǎn)染

1.4.1Fas-siRNA序列 采用已被驗(yàn)證能有效沉默F(xiàn)as mRNA的序列:ACCAAAUGCAAGAAACAAA dTdT(正義鏈) dTdT UGGUUUACGUUCUUUGUUU(反義鏈)[5]。

1.4.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前1 d將鋪滿培養(yǎng)瓶 80%～90%原代SD大鼠椎間盤細(xì)胞進(jìn)行傳代，以2×105～4×105/孔的密度接種于6孔板中。采用Lipofectamine 2000+ Opti MEM I脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染。采用陰性對照siRNA，轉(zhuǎn)染后48 h培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理

1.5.1IL-1β(10 ng/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)對陰性siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞Fas表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染后48 h的椎間盤細(xì)胞，共設(shè)5組均更換為1% FBS培養(yǎng)基，加10 ng/ml IL-1β分別培養(yǎng)0、4、8、16、32 h， RT-PCR檢測Fas mRNA表達(dá)，Western blot檢測Fas蛋白表達(dá)水平。

1.5.2IL-1β刺激后的椎間盤細(xì)胞與FasL共培養(yǎng)后Fas表達(dá)及凋亡情況觀察 轉(zhuǎn)染后48 h的椎間盤細(xì)胞分為5組: N：作為對照組，陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞不加FasL培養(yǎng)在1%FBS培養(yǎng)基中(在8 h后重新更換1%FBS培養(yǎng)基)；N-20 ng：陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞加1%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，重新更換1%FBS培養(yǎng)基，加入終濃度為20 ng/ml FasL；N-IL：陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與10 ng/ml IL-1β預(yù)培養(yǎng)8 h后(1%FBS培養(yǎng)基)，重新更換1%FBS培養(yǎng)基，加入終濃度為20 ng/ml FasL；Si-20 ng：Fas-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞加1%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，重新更換1%FBS培養(yǎng)基，加入終濃度為20 ng/ml FasL；Si-IL：Fas-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與10 ng/ml IL-1β預(yù)培養(yǎng)8 h后(1%FBS培養(yǎng)基)，重新更換1%FBS培養(yǎng)基，加入終濃度為20 ng/ml FasL；加入終濃度為20 ng/ml FasL后再共培養(yǎng)24 h。即siRNA轉(zhuǎn)染后80 h后，細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染或提取總RNA和總蛋白，分別檢測以下指標(biāo)。同時(shí)采用Hochest 33258染色評估細(xì)胞凋亡情況，以相互驗(yàn)證細(xì)胞凋亡評測情況。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1RT-PCR檢測Fas的mRNA表達(dá)水平 TRIzoL法提取總RNA，兩步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，收集PCR產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，圖像分析軟件進(jìn)行光密度掃描分析。Fas上、下游引物為5′-GCATCTTTGAGGGTTTGGA-3′，5′-CATTTGGTGTTGCTGGTTC-3′；退火溫度50 ℃，產(chǎn)物長度409 bp。

1.6.2Western blot檢測Fas的蛋白表達(dá)水平 于各時(shí)間點(diǎn)用RIPA裂解液分別提取總蛋白備用；制備凝膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜；免疫雜交：轉(zhuǎn)膜后PVDF膜孵育Fas一抗4 ℃過夜 (稀釋度均為1 ∶1 000)；1×PBST洗滌，室溫孵育β-actin二抗(抗稀釋度1 ∶1 000) 1 h；曝光顯影、照像留底；圖像分析系統(tǒng)計(jì)算條帶的灰度×面積值。各組Fas條帶值同相應(yīng)的β-actin條帶值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

圖1 原代內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細(xì)胞鑒定 ×100

A:HE染色顯示細(xì)胞呈多角形或短梭形，核為圓形或橢圓形，位于胞質(zhì)中央，呈藍(lán)紫色;B:甲苯胺蘭染色顯示基質(zhì)藍(lán)染，核仁亦呈藍(lán)色著色;C:Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色，細(xì)胞核基本不著色

1.6.3流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 用Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌2次，離心收集全部細(xì)胞，每管加入膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液 195 μl，5 μl Annexin V-FITC 混勻后，再加入10 μl 碘化丙啶，混勻，避光、室溫反應(yīng)5 min，EpicsALtra流式細(xì)胞儀分析得到細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1IL-1β(10ng/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)對陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞Fas表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，10 ng/ml的IL-1β和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞共培養(yǎng)，在4 h開始Fas mRNA就有所上調(diào)，但僅32 h時(shí)和對照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。Western blot法檢測Fas蛋白表達(dá)水平無明顯差異，可見 10 ng/ml的IL-1β對陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)影響作用不明顯。

圖2 RT-PCR法檢測IL-1β(10ng/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)對陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)的影響

2.2IL-1β刺激后的椎間盤細(xì)胞與FasL共培養(yǎng)后Fas表達(dá)及凋亡情況

2.2.1RT-PCR檢測Fas 的mRNA表達(dá)水平 10 ng/ml IL-1β刺激8 h后，和20 ng/ml FasL共培養(yǎng)24 h，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Si-20 ng、Si-IL組較對照組Fas mRNA的表達(dá)分別降低了70%、40.6%；而N-20 ng、N-IL組較對照組Fas mRNA的表達(dá)均升高，分別是對照組的1.53倍、1.99倍。各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3) (P<0.05)。

圖3 RT-PCR檢測FasL對轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)影響

2.2.2Western blot檢測Fas的蛋白表達(dá)水平 10 ng/ml IL-1β刺激8 h后，和20 ng/ml FasL共培養(yǎng)24 h，Western blot檢測結(jié)果顯示，Si-20 ng、Si-IL組較對照組Fas 蛋白的表達(dá)分別降低了37.8%、25.8%；而N-20 ng、N-IL組較對照組Fas 蛋白的表達(dá)均升高，分別是27.9%、37.2%。 Si-20 ng、Si-IL、N-20 ng、N-IL組與對照組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4、表1)，結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。

圖4 Western blot法檢測FasL對轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fas 蛋白表達(dá)變化的影響

表1 Western blot檢測Fas的蛋白表達(dá)水平的組間比較統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

與N組比較:*P<0.05；與Si-IL組比較：#P<0.05

2.2.3流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 Fas-siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞Si-20 ng、Si-IL組較相同F(xiàn)asL濃度共培養(yǎng)的N-20 ng、N-IL組凋亡率明顯降低(圖5)；但Fas-siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞Si-20 ng組與Si-IL組之間、Si-20 ng組與對照組之間細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析仍然存在差異 (表2)。

3 討論

既往研究[5-9]表明，F(xiàn)as/FasL凋亡系統(tǒng)是椎間盤細(xì)胞的主要凋亡途徑，并且該凋亡途徑的啟動是受多種因素影響的。Fas、FasL的表達(dá)部位(正常/非正常)、表達(dá)形態(tài)(膜態(tài)還是可溶性態(tài))、表達(dá)水平、二者的多態(tài)性，細(xì)胞所處的微環(huán)境狀態(tài)、是否有外源因子的存在等等都有可能導(dǎo)致啟動結(jié)果的不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示，在兩組未沉默F(xiàn)as基因的椎間盤細(xì)胞中，經(jīng)IL-1β預(yù)處理的細(xì)胞較未經(jīng)IL-1β預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在兩組沉默F(xiàn)as基因的椎間盤細(xì)胞中，經(jīng)IL-1β預(yù)處理的細(xì)胞較未經(jīng)IL-1β預(yù)處理的細(xì)胞凋亡率增高幅度明顯減小，兩組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)，椎間盤細(xì)胞與FasL共培養(yǎng)，無論是否沉默F(xiàn)as基因，其細(xì)胞凋亡率和對照組比較均有升高，而未沉默 Fas基因的椎間盤細(xì)胞凋亡率升高更明顯；使用RT-PCR和Western blot分別在mRNA 和蛋白兩個(gè)水平檢測到Fas的表達(dá)變化與椎間盤細(xì)胞的這種凋亡率具有明顯相關(guān)性。但是，本研究顯示，用10 ng/ml IL-1β和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的大鼠椎間盤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，在8 h時(shí)Fas mRNA和蛋白檢測卻都沒有發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)；而與FasL共培養(yǎng)后，椎間盤細(xì)胞的Fas表達(dá)反而升高。這一現(xiàn)象表明椎間盤細(xì)胞在經(jīng)IL-1β預(yù)處理后的確增加了對FasL應(yīng)答的敏感性，但導(dǎo)致這種凋亡敏感性增加的確切機(jī)制尚不明確。該結(jié)果同時(shí)也再次驗(yàn)證了FasL具有上調(diào)椎間盤細(xì)胞凋亡受體Fas表達(dá)的作用[5]。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測FasL對轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率的影響

表2 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率

與N組比較:*P<0.05；與Si-IL組比較：#P<0.05

實(shí)驗(yàn)中通過對Fas mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果檢測雖未能完全明確經(jīng)IL-1β預(yù)處理后增加了對FasL應(yīng)答敏感性的確切機(jī)制。但這一結(jié)果提示了IL-1β可能是通過改變Fas受體的應(yīng)答狀態(tài)而不是上調(diào)Fas受體的表達(dá)而增加椎間盤細(xì)胞對FasL凋亡應(yīng)答敏感性的，正是這種Fas受體應(yīng)答狀態(tài)的變化導(dǎo)致了椎間盤細(xì)胞在低水平的FasL作用下就會產(chǎn)生高水平的凋亡。而后期細(xì)胞凋亡的增加則是凋亡受體Fas表達(dá)增加的原因，因?yàn)镕asL本身就具有上調(diào)Fas表達(dá)的作用。但這種凋亡敏感性可被Fas-siRNA所抑制。這就為利用RNA干擾的方法抑制椎間盤退變性疾病提供了可能。

Fas的表達(dá)易受各種因素影響，異常機(jī)械應(yīng)力、過度負(fù)荷、創(chuàng)傷等均可上調(diào)Fas的表達(dá)水平從而增加了椎間盤細(xì)胞的過度凋亡[10-12]。綜合以前研究結(jié)果顯示，IL-1β不僅能夠上調(diào)Fas的表達(dá)水平，而且可以改變Fas受體應(yīng)答狀態(tài)，從而產(chǎn)生超常的凋亡作用，導(dǎo)致椎間盤組織中細(xì)胞數(shù)量的減少。本實(shí)驗(yàn)從另一個(gè)側(cè)面說明了炎性環(huán)境對椎間盤細(xì)胞超常凋亡的加速作用[8]。減輕或者抑制椎間盤部位的炎性反應(yīng)對延緩椎間盤退變可能有著重要作用。