黃 偉，王邦寧，趙 韌，朱繼田，李 倩，侯道榮

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床上心臟內(nèi)科和心臟外科常見的病理生理現(xiàn)象，比如急性心肌梗死患者接受溶栓或介入治療及血運重建均會造成I/R損傷[1-2]。心肌缺血再灌注損傷是缺血的心肌恢復(fù)血液供應(yīng)后心肌細(xì)胞在形態(tài)、功能、代謝和電生理學(xué)表現(xiàn)等方面發(fā)生一系列的損傷表現(xiàn)[3]。這種損傷會激活細(xì)胞凋亡和自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。通過有效的干預(yù)手段來減輕或預(yù)防I/R 損傷是重要的臨床課題。有研究[5]表明使用抗CD47單克隆抗體阻斷TSP1/CD47信號，或者敲除CD47，可以減輕小鼠心臟、腎臟、肝臟和組織皮瓣損傷。該研究采用大鼠原代心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧 (hypoxia/ reoxygenation，H/R) 損傷模型，從抗氧化及抗凋亡等方面探討抗體封閉CD47對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞H/R損傷的作用及其機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物出生1～3 d的SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雌雄不限，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2主要試劑胎牛血清、胰酶(Trypsin) 和二甲基亞砜(DMSO) 購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH，A020-1)、肌酸激酶(CK，A032)、超氧化物歧化酶(SOD，A001-1)、丙二醛(MDA，A003-1)和一氧化氮(NO，A012-1) 檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國ENZO公司；DHE(dihydroethidium)購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(556547)購自美國BD Biosciences公司； CD47抗體(sc-53050)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；eNOS抗體 (32027)、p-eNOS抗體 (9570)和GAPDH抗體(5174)購自美國Cell Signal Technology公司。

1.3主要儀器低氧/高氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(Model 3131)和普通細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERACELL 150i)購自美國Thermo Scientific公司；96孔多功能酶標(biāo)檢測儀(Eon)購自美國BioTeK公司；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)購自美國BD Biosciences公司。

1.4方法

1.4.1乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 參考文獻[6]方法，心肌細(xì)胞分離采用酶消化、差速貼壁法。心肌細(xì)胞培養(yǎng)液為90% DMEM、10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml，以6×105/ml接種到6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，培養(yǎng)3～4 d用于實驗。

1.4.2心肌細(xì)胞H/R 模型的建立 原代培養(yǎng)3～4 d后呈亞融合狀態(tài)，低氧處理時，將細(xì)胞放入低氧/高氧培養(yǎng)箱中(1% O2，94% N2，5% CO2)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；復(fù)氧處理時，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，置于常氧培養(yǎng)箱中(95%空氣, 5% CO2, 37 ℃)培養(yǎng)12 h。常氧培養(yǎng)細(xì)胞用于對照。所有實驗重復(fù)3次。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1心肌細(xì)胞活力檢測 采用MTT比色法檢測心肌細(xì)胞活力。細(xì)胞計數(shù)后在96孔板上以1×104/孔接種細(xì)胞。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，室溫低速震蕩30 min充分溶解。酶標(biāo)儀測定各孔在570 nm波長的吸收值。細(xì)胞存活率=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.5.2心肌細(xì)胞凋亡的檢測 使用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用PBS清洗3次，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，離心后用AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸，制成單細(xì)胞懸液，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)室溫避光孵育10 min后，加入300 μl 1×緩沖液終止反應(yīng)，混勻后流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.3LDH、CK、SOD、MDA和NO水平檢測 收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測LDH、CK、SOD、MDA和NO水平。

1.5.4活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)染色 細(xì)胞使用DPBS洗滌3次；加入DHE(10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min；DPBS洗滌3次后熒光顯微鏡拍照。熒光定量使用Image J 軟件。

1.5.5Western blot 采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉3 h 后，分別加入eNOS抗體(1 ∶1 000)、p-eNOS抗體(1 ∶1 000)和anti-GAPDH抗體(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，增強化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。蛋白表達定量使用Image J軟件。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、CK、SOD、MDA和NO含量變化

與Control組比較：***P<0.001；與H/R組比較：##P<0.01，###P<0.001

2 結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞存活率的比較心肌細(xì)胞低氧和復(fù)氧處理明顯增加了細(xì)胞死亡，與Control組(97.05±1.38)%比較，H/R組細(xì)胞存活率(39.46±2.96)%明顯下降(P<0.01)；CD47抗體處理增加了低氧和復(fù)氧損傷細(xì)胞的存活率，與H/R組相比，CD47+H/R組(78.52±4.39)%心肌細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.01)。

2.2各組心肌細(xì)胞上清液中LDH、CK、SOD、MDA和NO水平的比較在H/R組中，CK、LDH和MDA的水平顯著高于Control組(P<0.01)，與H/R組相比，CD47+H/R組CK、LDH和MDA的水平顯著減少(P<0.01)。與Control組相比，H/R組SOD和NO水平明顯降低(P<0.01)；與H/R組比較，CD47+H/R組SOD和NO水平顯著增加(P<0.01)。各組心肌細(xì)胞的CK、LDH、MDA、SOD和NO水平見表1。

2.3各組心肌細(xì)胞凋亡率的影響在早期的凋亡中，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)表達于細(xì)胞膜。膜粘蛋白(annexin)對磷脂絲氨酸具有高親和性。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的膜粘蛋白V(Annexin V)染色可以用于鑒別早期凋亡細(xì)胞。由于壞死細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂或者疏松，PI能夠穿過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合。因此可以用于區(qū)別凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞。與Control組相比，H/R組的細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總死亡率均顯著增高(P<0.01)，與H/R組比較，CD47+H/R組的細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總死亡率則明顯下降(P<0.01)。各組細(xì)胞流式檢測結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡比例

與Control組比較：***P<0.001；與H/R組比較：##P<0.01，###P<0.001

2.4各組心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的比較熒光定量(圖1)結(jié)果表明，心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧處理明顯使細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS，和Control組比較，H/R組熒光更強(P<0.01)；而CD47抗體封閉顯著減少細(xì)胞低氧/復(fù)氧處理后ROS的產(chǎn)生，和H/R組比較，CD47+H/R組熒光明顯減弱(P<0.01)。

圖1 Control組、H/R組和CD47+H/R組細(xì)胞ROS染色結(jié)果

A：各組心肌細(xì)胞ROS染色；B：各組心肌細(xì)胞ROS染色定量結(jié)果比較；與Control組比較：**P<0.01；與H/R組比較：##P<0.01

2.5各組心肌細(xì)胞eNOS/NO通路影響的比較定量結(jié)果(圖2)表明，三組細(xì)胞eNOS蛋白表達量無明顯差異；與Control組比較，H/R組p-eNOS表達明顯下降(P<0.01)，CD47表達明顯上升(P<0.01)；與H/R組比較，CD47+H/R組p-eNOS表達顯著上升(P<0.01)，CD47表達顯著降低(P<0.05)。

3 討論

CD47是一種具有五個跨膜域的蛋白質(zhì)，在大多數(shù)細(xì)胞類型中廣泛表達并參與到先天免疫反應(yīng)中。Bauer et al[9]報道在缺血狀態(tài)CD47在血管細(xì)胞中的表達顯著上調(diào)。CD47被TSP1激活后可通過降低鈣通量抑制eNOS活性從而減少NO的產(chǎn)生[10]。Sharifi-Sanjani et al[11]發(fā)現(xiàn)，CD47下調(diào)可以保護心臟壓力，緩解心臟衰竭，提高缺血性皮瓣和皮膚移植的存活率，同時也能抑制小鼠肝、腎I/R損傷[5]。離體心肌細(xì)胞H/R處理能夠造成心肌細(xì)胞損傷，同時也是模擬在體外環(huán)境下心肌I/R的常用模型。大鼠心肌發(fā)生I/R損傷后，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡增多、胞質(zhì)中CK、CK-MB、AST和LDH大量釋放。通過細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞培養(yǎng)基中CK、CK-MB、AST、LDH 含量的測定能夠反映心肌細(xì)胞的損傷程度[12]。本研究中CD47下調(diào)可增強eNOS/NO信號，從而激活eNOS并增加NO產(chǎn)生來緩解I/R的損傷。這一結(jié)果和Yao et al[13]研究結(jié)果一致。此外，CD47抗體處理引起體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞CD47表達下降，減輕了H/R心肌細(xì)胞損傷的作用，顯著降低了CK和LDH水平。

圖2 三組細(xì)胞CD47、eNOS、p-eNOS蛋白表達

與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；與H/R組比較：#P<0.05，##P<0.01

研究[14]證實, 氧化應(yīng)激是I/R的主要病理表現(xiàn)。心肌細(xì)胞在I/R的過程中產(chǎn)生大量氧自由基，啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，細(xì)胞損傷、凋亡和壞死。在心肌細(xì)胞發(fā)生H/R損傷過程中，細(xì)胞氧化應(yīng)激也會被激活[15]。氧化應(yīng)激主要由ROS介導(dǎo),造成細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、VitC、VitE等抗氧化物質(zhì)大量消耗，進而引起生物膜中脂質(zhì)成分發(fā)生氧化并產(chǎn)生MDA。氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用，既可直接損傷細(xì)胞DNA誘導(dǎo)凋亡，還可以通過激活線粒體途徑等間接方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與心肌I/R的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是其發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)之一[5]。研究[12]顯示，缺血和再灌注均可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，缺血是心肌細(xì)胞凋亡的啟動因素，再灌注損傷可加重心肌細(xì)胞凋亡，并使凋亡不可逆轉(zhuǎn)。因此抗氧化應(yīng)激抑制凋亡成為探索這些疾病的發(fā)病機制及研制相關(guān)藥物的一個重要方向。本研究中，心肌細(xì)胞經(jīng)H/R處理使氧化應(yīng)激增加并降低了抗氧化能力；CD47下調(diào)增加心肌細(xì)胞抗氧化酶SOD的活性并減少了H/R心肌細(xì)胞MDA的產(chǎn)生。這些結(jié)果說明下調(diào)CD47可減少NADPH氧化酶源ROS的產(chǎn)生，增強細(xì)胞抗氧化能力并顯著減輕心肌細(xì)胞H/R引起的細(xì)胞凋亡。