王良芳，陳志武

缺血性損傷腦血管疾病是全球性的重大公共衛(wèi)生問題，研究腦缺血損傷的機(jī)制一直是臨床和基礎(chǔ)研究較為關(guān)注的課題之一。內(nèi)皮源性硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)和一氧化氮(nitric oxide, NO)均可由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放并參與缺血性腦損傷過程[1-3]。有研究[4-5]表明缺血性腦損傷可激活RhoA-ROCK(Ras homolog gene family, member A/Rho associated coiled coil-forming kinase)通路，并且內(nèi)皮源性NO可抑制RhoA-ROCK通路的活性，但迄今尚不清楚缺血性腦損傷中，內(nèi)皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者中，孰是最先改變的原發(fā)因素以及內(nèi)皮源性H2S是否也可抑制RhoA-ROCK通路的活性。因此，該文觀察了大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者在低氧性損傷中的動(dòng)態(tài)變化，并探討了內(nèi)皮源性H2S對(duì)RhoA-ROCK通路活性的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑、膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司； CCK-8試劑盒、NO檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RhoA活性測(cè)定試劑盒購自美國骨架細(xì)胞公司；胎牛血清、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗β-actin多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Anti-Von Willebrand Factor antibody、兔抗ROCK1和ROCK2抗體、eNOS抗體、CSE抗體購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，200～300 g，飼養(yǎng)溫度在(22±2)℃，通風(fēng)良好，可自由攝水進(jìn)食。取大鼠5只，10%水合氯醛麻醉后置75%乙醇浸泡3 min。將大鼠置無菌操作臺(tái)上，心臟灌流無菌PBS，直至肝臟和舌頭發(fā)白。無菌狀態(tài)下迅速斷頭取腦，顯微鏡下小心剝離腦血管后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中預(yù)先加有膠原酶Ⅱ(工作濃度為2 mg/ml)的EP管中，用眼科鑷將腦血管反復(fù)剪碎后37 ℃水浴消化30 min，之后離心棄上清液，加入含內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑和20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后接種于培養(yǎng)皿，CO2恒溫恒濕孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液去除未貼壁和壞死細(xì)胞，之后視細(xì)胞生長狀態(tài)換液；待80%細(xì)胞融合時(shí)，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代，之后按要求分組實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光染色檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞vWF表達(dá) 倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；vWF免疫熒光標(biāo)記染色：取第二代狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化后接種于放有載玻片的培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞爬滿載玻片 80%時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液；用預(yù)冷PBS清洗3次，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS 清洗3次，0.1% Triton-100室溫處理10 min; PBS清洗3次，加入封閉液室溫孵育1 h; 加入羊抗大鼠vWF多克隆抗體(1 ∶100) 4 ℃過夜；次日PBS清洗后，加入熒光二抗室溫孵育 1 h；PBS 清洗3次，加入DAPI染色5 min，熒光封片劑封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

1.2.3低氧模型制備 低氧24 h前培養(yǎng)基換成厭氧培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃、N295%、CO25%的可控厭氧室中。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長滿后，經(jīng)胰酶消化離心重懸后制成單細(xì)胞懸液，10% FBS培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為8×104/ml，每孔100 μl接種于5塊96孔板，每板設(shè)置空白對(duì)照，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后放入N295%、CO25%厭氧培養(yǎng)箱，分別在1、2、4、8、24 h各取出1塊，并取出相應(yīng)的空白對(duì)照板；向每孔加入10 μl CCK-8溶液，震蕩混勻后室溫下孵育1～3 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取吸光度(optical density，OD)值。細(xì)胞活力(%)=(加藥細(xì)胞OD-空白OD)/(對(duì)照細(xì)胞OD-空白OD)×100%。

1.2.5亞硝酸還原法檢測(cè)NO含量 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO代謝產(chǎn)物NO3在硝酸還原酶的作用下生成NO2，NO2酸性條件下與α-萘胺及對(duì)-氨基苯磺酸生成紅色偶氮化合物。按說明書要求將試劑和待測(cè)樣品分別加入各管后靜置10 min，雙蒸水調(diào)零，酶標(biāo)儀于波長550 nm處測(cè)各管OD值。

1.2.6亞甲基藍(lán)分光光度法測(cè)定H2S含量 醋酸鋅可以吸收硫化氫生成硫化鋅沉淀，酸性條件下硫離子可與三氯化鐵 (FeCl3)和N,N-二甲基-對(duì)苯二胺硫酸鹽(NDPA)反應(yīng)，室溫下生成穩(wěn)定的亞甲基藍(lán)，在波長670 nm處測(cè)其OD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出H2S的濃度。

1.2.7G-LISA檢測(cè)RhoA活性 按實(shí)驗(yàn)要求分組，待大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞長滿約80%后，置于冰上加冰冷裂解液提取蛋白；用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，平衡各樣本濃度；蛋白質(zhì)提取物轉(zhuǎn)移到Rho-GTP-結(jié)合蛋白預(yù)包被的平板上；400 r/min的振蕩器上4 ℃孵育30 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；加RhoA一抗，400 r/min的振蕩器上室溫孵育45 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；加二抗振蕩器400 r/min室溫孵育45 min，洗滌液常溫洗2次，每次甩干；每孔加HRP AB液室溫下15 min后，加入HRP終止緩沖液；酶標(biāo)儀在波長490 nm處讀取OD值。

1.2.8Western blot檢測(cè)不同低氧時(shí)間胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、Rho激酶ROCK1和ROCK2蛋白含量變化 分別于規(guī)定的低氧時(shí)間收集相應(yīng)細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取蛋白。用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量，各組取30 μg等量蛋白煮沸變性，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加入兔抗鼠ROCK、eNOS、CSE多克隆抗體一抗(1 ∶1 000)孵育；4 ℃過夜，次日洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入顯色液顯影曝光內(nèi)皮細(xì)胞L顯色，Image J定量分析灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。兩組之間獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組之間單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞鑒定光鏡下原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞為梭形或多邊形，旋渦狀生長，呈聚集狀，貼壁牢固(圖1A)。免疫熒光染色顯示：細(xì)胞核DAPI染色為藍(lán)色熒光，超過90%的細(xì)胞胞質(zhì)存在紅色熒光，說明內(nèi)皮細(xì)胞純度達(dá)90%(圖1B)。

圖1 原代培養(yǎng)的大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫熒光鑒定

2.2不同低氧時(shí)間對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響與control組比較，低氧時(shí)間延長細(xì)胞活力明顯下降。低氧8 h細(xì)胞活力下降了(39.3±4.3)%，低氧24 h后細(xì)胞活力下降(60.9±6.1)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明低氧可致大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降。見圖2。

2.3大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧后NO、H2S含量及RhoA活性的動(dòng)態(tài)變化大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧1、2、4、8、24 h后分別檢測(cè)H2S、NO含量及RhoA活性變化，與control組比較，低氧1 h后H2S含量顯著下降(F=4.23，P<0.01)；NO含量在低氧4 h后才開始顯著下降(F=3.19，P<0.05)；RhoA活性低氧8 h后顯著增加(F=7.31，P<0.01)。上述三者變化差距隨時(shí)間延長而顯著加大。見圖3。因此定量結(jié)果表明在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧中，H2S降低最早，NO次之，RhoA活性增加再次之。

圖2 不同低氧時(shí)間對(duì)大鼠腦血管細(xì)胞活力的影響

與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞CSE、eNOS、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示：CSE和eNOS蛋白隨低氧時(shí)間延長呈持續(xù)下降趨勢(shì)，低氧4 h時(shí)CSE蛋白表達(dá)較正常組有了顯著下降；低氧8 h后eNOS蛋白才開始明顯降低；相反ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)隨低氧時(shí)間延長呈上升趨勢(shì)，低氧8 h時(shí)ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)顯著增加。見圖4。上述各蛋白的變化隨低氧時(shí)間延長而顯著加大。

2.5H2S對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA活性的影響

2.5.1內(nèi)源性H2S對(duì)RhoA活性的影響 與control組比較，RhoA特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(C3 Transferase,C3 TF)(25 μg/ ml，8 h)可顯著抑制RhoA活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但CSE抑制劑DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)(10 mmol/L，4 h)可顯著加RhoA活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示內(nèi)源性H2S可抑制RhoA的激活。見圖5。

2.5.2內(nèi)源性和外源性H2S對(duì)C3轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)的RhoA活性降低的影響 與C3TF組比較，PPG組(10 mmol/L，4 h)可顯著抑制C3TF誘導(dǎo)的RhoA活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示內(nèi)源性H2S均可增強(qiáng)C3TF誘導(dǎo)的RhoA活性降低。H2S供體NaHS(50 μmol/L、30 min)可直接增強(qiáng)C3TF誘導(dǎo)的RhoA活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖3 大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧H2S、NO的含量和RhoA活性的動(dòng)態(tài)變化(n=3)

A：H2S含量動(dòng)態(tài)變化；B：NO含量動(dòng)態(tài)變化；C：RhoA活性動(dòng)態(tài)變化；與 control組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.5.3外源性H2S對(duì)RhoA活性的影響 外源性H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)10、50和100 μmol/L處理30 min，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可明顯并呈一定的濃度依賴性地降低RhoA活性，提示外源性H2S也可抑制RhoA的激活。見圖6。

圖4低氧不同時(shí)間誘導(dǎo)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后CSE、eNOS、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響(n=3)

A：CSE表達(dá)水平；B：eNOS表達(dá)水平；C：ROCK1/2表達(dá)水平；與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖5 PPG對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA活性的影響(n=3)

與control組比較：*P<0.05；與C3 TF組比較：#P<0.05

圖6 NaHS對(duì)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA活性的影響(n=3)

與control組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

小G蛋白的Rho家族包括RhoA、Rac1和Cdc42[6-7]，其中RhoA是最具特色的蛋白質(zhì)，它作為分子開關(guān)在無活性的GDP結(jié)合和活性GTP結(jié)構(gòu)之間循環(huán)，與下游靶點(diǎn)相互作用以引發(fā)各種細(xì)胞反應(yīng)。研究[8]表明，RhoA-ROCK通路與心血管疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、心力衰竭等，其抑制劑法舒地爾(fasudil)可以治療許多心血管疾病。

缺血性腦損傷是一嚴(yán)重危害人類健康的腦血管疾病，腦血管內(nèi)皮與缺血性腦損傷的發(fā)生密切相關(guān)。內(nèi)皮源性NO和H2S是調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮舒張功能的兩種重要的血管內(nèi)皮舒張因子，其改變參與了腦缺血損傷過程。在急性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，有研究[9]顯示腦缺血可激活ROCK，而ROCK抑制劑fasudi或Y-27632可抑制ROCK的激活，并減少腦梗死面積。因此，RhoA-ROCK通路的激活也是腦缺血損傷過程中的一個(gè)因素。本研究表明在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷過程中，內(nèi)皮源性H2S和內(nèi)皮源性NO分別在低氧1 h和4 h時(shí)發(fā)生了明顯降低，而RhoA-ROCK通路活性在8 h時(shí)才有明顯增加。并且Western blot檢測(cè)結(jié)果也表明內(nèi)皮源性H2S合成酶CSE和內(nèi)皮源性合酶eNOS蛋白表達(dá)的降低及ROCK蛋白表達(dá)的增高分別發(fā)生在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧的4 h、8 h和8 h時(shí)，也支持著內(nèi)皮源性H2S降低發(fā)生最早。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明內(nèi)皮源性H2S在低氧1 h時(shí)就明顯降低了，但其合成酶CSE蛋白表達(dá)在4 h時(shí)才顯著降低，提示在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧過程中，H2S合成酶CSE的活性也有顯著降低，并且早于其蛋白表達(dá)的下降。因此，本研究結(jié)果表明在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷過程中，內(nèi)皮源性H2S降低發(fā)生最早，其次為NO，而RhoA-ROCK通路的激活遲于前二者。

在低氧損傷過程中，大鼠腦血管內(nèi)皮中RhoA-ROCK通路改變遲于NO和H2S的降低，但前者的改變是否由NO和H2S降低引起的呢？有研究[10]表明NO可阻止RhoA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，從而抑制RhoA的活化。本研究表明內(nèi)源性H2S和外源性H2S均可抑制RhoA的激活。并且內(nèi)源性和外源性H2S均可增強(qiáng)C3 TF誘導(dǎo)的RhoA活性降低，也支持著H2S可抑制RhoA的激活。因此，結(jié)合前述的內(nèi)皮源性H2S降低發(fā)生在前，RhoA-ROCK通路激活發(fā)生在后，可以認(rèn)為在低氧損傷過程中，大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA-ROCK通路的激活可能是繼發(fā)于H2S的降低。至于內(nèi)皮源性H2S與NO的相互作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，此處不再贅述了。

綜上所述，在大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷過程中，內(nèi)皮源性H2S降低發(fā)生最早，其次為NO，而RhoA-ROCK通路激活發(fā)生在后，可能是繼發(fā)于H2S的降低。