張先虎，朱俊德，龍婷婷，王俊婕，康朝勝

我國每年死于腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者約130萬，在我國致死和致殘原因中均名列第一[1]。因此，如何治愈或延緩腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)病變成為亟需解決的問題。神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多能干細胞，可以分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等多種神經(jīng)細胞[2]。NSCs可為神經(jīng)損傷的修復提供源源不斷的原材料，但是其發(fā)揮修復損傷的調(diào)控機制仍不是十分清楚。Wnt/β-catenin信號通路是神經(jīng)發(fā)育過程中的一條基本通路，可調(diào)控NSCs細胞周期的進程，促使NSCs增殖，但是其對NSCs分化方向的影響卻沒有達成共識[3-4]。該實驗通過研究Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號通路后對小鼠海馬源性 NSCs的增殖與分化的影響，尋找調(diào)控NSCs增殖和分化的關鍵因素，以期為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防與治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料隨機選取20只新生24 h昆明種小鼠(體質(zhì)量2～3 g)，清潔級，合格證號：SCXK(黔)[2018-0001]，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗過程中對動物處理嚴格執(zhí)行動物倫理學標準。DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基與B27 復合物購自美國 Gibco 公司；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor， EGF)、Wnt3a蛋白購自美國 Peprotech 公司；胎牛血清(FBS)、多聚賴氨酸購自美國 Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25% TRYpsin/EDTA、青霉素-鏈霉素溶液購自美國Hyclone 公司；巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、鼠單克隆5-溴-2-脫氧尿核苷(Brd U)、鼠單克隆神經(jīng)元特異烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、兔抗鼠單克隆巢蛋白(Nestin)與兔IgG SABC-FITC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物公司；4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚溶液(DAPI)、抗熒光淬滅封片劑購自北京Solarbio公司；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、6孔板、15 ml 離心管購自無錫耐思生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1NSCs分離及培養(yǎng) 新生24 h昆明種小鼠斷頭處死，無菌條件下冰上取出雙側大腦，放入盛有4 ℃ PBS 溶液培養(yǎng)皿中漂洗，然后分離海馬組織，仔細剝離腦膜及血管將海馬組織剪碎至2.0 mm 左右，加入0.25% Trypsin/EDTA 2.0 ml，37 ℃消化后用槍頭輕柔吹打至乳糜狀，加入10% FBS終止消化。300目篩網(wǎng)濾過后成細胞懸液，細胞懸液用PBS 溶液清洗一次后加入NSCs完全培養(yǎng)基(DMEM/F12、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、20 ng/ml B27、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，以細胞濃度為1×106/ml接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d半量換液一次，6～7 d傳代。

1.2.2NSCs傳代培養(yǎng) 無菌條件下將細胞懸液轉移至離心管中，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入0.05% Trypsin/EDTA 復合消化酶500 μl，37 ℃消化后用槍頭輕柔吹打20次，加入2.0 ml PBS稀釋消化酶，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入NSCs完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。

1.2.3NSCs誘導分化 預先將6孔板以多聚賴氨酸包被。取培養(yǎng)3 d的NSCs懸液2.0 ml，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，分別以NSCs培養(yǎng)基、NSCs分化培養(yǎng)基(DMEM/F12、20 ng/ml B27、10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素)2.0 ml重懸，接種至6孔板，每組2個孔加入并標記。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 d后，行免疫熒光鑒定。

1.2.4NSCs及分化細胞免疫熒光鑒定 取出6孔板，吸出上清液，經(jīng)清洗、4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100 通透、3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶后滴加正常山羊血清封閉液(1 ∶10)，室溫封閉，20 min，甩干，不洗。分別滴加Nestin、NSE、GFAP單克隆抗體(1 ∶100)，對照組不加一抗，用 0. 01 mol/LPBS 代替；濕盒中4 ℃過夜孵育后PBS清洗。分別滴加生物素標記小鼠IgG(1 ∶100)、羊抗鼠IgG(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。滴加SABC-FITC(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。加入 DAPI 進行細胞核染色，室溫避光孵育 5～10 min，PBS清洗(500 μl/孔×5 min×3次)。加入抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5NSCs的Wnt3a處理及分組 將傳代2～3次所得NSCs分為正常對照組(sham組)與Wnt3a組，Wnt3a組再分為Wnt3a低劑量組(10 μg/ml)、Wnt3a中劑量組(25 μg/ml)和Wnt3a高劑量組(50 μg/ml)。

1.2.6CCK-8檢測 將各組處理后的神經(jīng)球制成NSCs單細胞懸液，以2×104/孔的密度種植于96孔板內(nèi)，96孔板的周圍一圈加無菌PBS培養(yǎng)液(因為周圍一圈最容易蒸發(fā)，添加水可緩解蒸發(fā))。按實驗順序在每孔中加入100.0 μl相應組別的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，同時設立僅加培養(yǎng)基但不含NSCs的孔作為空白對照。培養(yǎng)結束后，每孔內(nèi)加入濃度10%的10.0 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育6 h。用全波長酶標儀在450 nm處檢測吸光度(OD)值。每組細胞設置3個復孔，每個實驗重復3次。結果判定：OD值與培養(yǎng)體系中所含的活細胞數(shù)成正比，OD值越大代表培養(yǎng)體系中的細胞數(shù)量越多，因此，相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，OD值越大說明細胞增殖的越多，增殖的能力越強。

1.2.7流式細胞儀檢測 將上述分組處理后的NSCs培養(yǎng)48 h；收集細胞后用PBS洗滌細胞一次(離心2 000 r/min、5 min)，收集細胞并調(diào)整細胞濃度為1.0×106/ml，取1.0 ml單細胞懸液；制備的單細胞懸液離心后，去除上清液，在細胞中加入體積分數(shù)為75%冷乙醇500 μl固定(4 ℃過夜)，染色前用PBS洗去固定液，細胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾一次；加入100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光；流式細胞術分析。

1.2.8Western blot檢測 將上述分組處理后的NSCs培養(yǎng)48 h后置于6孔培養(yǎng)板中誘導貼壁，經(jīng)過自然分化6 d后，將所得細胞進行裂解、離心提取蛋白，BCA 蛋白定量后，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳和轉膜，用溶于TBST的5%脫脂牛奶進行封閉， 室溫孵育1 h后，加入GFAP、NSE單克隆抗體(1 ∶100)，室溫孵育1 h，置于4 ℃環(huán)境中過夜，過夜后室溫下復溫30～60 min，然后用TBST洗滌，隨即加入相應二抗(1 ∶200)，室溫孵育1 h，孵育完成后用TBST洗滌。加入曝光液后，拍照分析。

2 結果

2.1NSCs原代培養(yǎng)結果完整分離出新生24 h小鼠海馬組織，見圖1；原代細胞培養(yǎng)1 d 后可見部分無突起、折光性良好的“滿天星”樣的懸浮細胞，見圖2A；2～3 d 后可見由不同數(shù)目細胞組成的、大小不等的細胞球，形態(tài)規(guī)則，細胞的折光性強，懸浮穩(wěn)定，呈“桑葚”狀，見圖2B；5～7 d后可見大量神經(jīng)細胞球，部分神經(jīng)細胞球可見中心折光性減弱，如“黑帽”樣，見圖 2C，此時位于內(nèi)部的細胞大量壞死，細胞懸浮穩(wěn)定性下降，開始出現(xiàn)貼壁分化的現(xiàn)象。

圖1 新生24 h小鼠海馬組織

圖2小鼠海馬組織NSCs原代培養(yǎng)×200

A：原代培養(yǎng)1 d的NSCs；B：原代培養(yǎng)2～ 3 d的NSCs球；C：原代培養(yǎng)5～ 7 d的NSCs球

2.2免疫熒光檢測結果原代培養(yǎng)的小鼠海馬干細胞Nestin染色陽性，并且聚集而成球形，見圖3A。NSCs貼壁后12～24 h出現(xiàn)以NSCs為中心向外周的細胞遷移，呈“齒輪”狀；遷移的細胞突起增多，胞體增大，見圖3B 。神經(jīng)元誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的NSCs經(jīng)NSE免疫熒光檢測，可見到胞體呈圓形，周圍有短突起樣的神經(jīng)元，見圖3C。NSCs經(jīng)GFAP免疫熒光檢測可見到具有較長突起的星形樣膠質(zhì)細胞，部分交織成網(wǎng)狀，見圖3D。

2.3CCK-8法檢測結果NSCs不同處理組培養(yǎng)48 h后細胞增殖活力結果見圖4。與sham組比較，Wnt3a低劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.576,F=1.445,P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.628，F(xiàn)=2.089,P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.364，F(xiàn)=2.770,P<0.01)。

圖3 NSCs及分化細胞的免疫熒光法鑒定結果 ×200

A：NSCs球，Nestin染色；B：NSCs球出現(xiàn)細胞遷移，Nestin染色；C：神經(jīng)元，NSE染色；D：星形膠質(zhì)細胞，GFAP染色

圖4 各組NSCs的CCK-8值

與Sham組比較：*P<0.01；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.05；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.01

2.4流式細胞儀檢測結果NSCs不同處理組培養(yǎng)48 h后細胞周期見圖5A～5D。與sham組比較，Wnt3a低劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.706，F(xiàn)=3.840,P<0.05)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.519，F(xiàn)=1.024，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.682，F(xiàn)=2.680，P<0.05)。與sham組比較，Wnt3a低劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.812，F(xiàn)=3.490，P<0.05)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.789，F(xiàn)=1.440，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.459，F(xiàn)=1.432，P<0.05)。見圖5E。

圖5 流式細胞儀檢測Wnt3a對NSCs周期的影響

A： 正常對照組(sham組)；B： Wnt3a低劑量組；C：.Wnt3a中劑量組；D： Wnt3a高劑量組；E： G1期和(S+G2)期的變化；與Sham組比較：*P<0.05；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.05；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.05

2.5Westernblot法檢測結果與sham組比較，Wnt3a低劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.343，F(xiàn)=1.136，P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.59，F(xiàn)=1.417，P<0.001)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.005，F(xiàn)=1.235，P<0.01)。見圖6B。與sham組比較，Wnt3a低劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.070，F(xiàn)=2.136，P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.488，F(xiàn)=4.259，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=76.03，F(xiàn)=4.413，P<0.01)。見圖6。

圖6 Western blot檢測Wnt3a對NSCs分化的影響

A：各組NSE、GFAP蛋白表達變化；B：NSE/β-actin相對灰度值比較；C：GFAP/β-actin相對灰度值比較；1：sham組，2：Wnt3a低劑量組，3：Wnt3a中劑量組，4：Wnt3a高劑量組；與sham組比較：*P<0.01；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.001；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.01

3 討論

NSCs是一類表達特殊標志蛋白Nestin，具有自我更新能力、多向分化潛能、低免疫源性等基本特征的神經(jīng)祖細胞[5-6]。在哺乳動物中，NSCs主要存在于側腦室的室管膜下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下層兩個部位[7]。NSCs可以不斷增殖并遷移至神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位，分化為不同類型的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，構成神經(jīng)系統(tǒng)的各種結構。NSCs的增殖和分化有利于神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育和修復，這為神經(jīng)系統(tǒng)的病變提供了有效的治療思路[8]。如何獲得穩(wěn)定成熟的NSCs，成為研究NSCs需要解決的首要問題。本實驗中觀察到自小鼠海馬分離的細胞在無血清培養(yǎng)基中大部分逐漸死亡、貼壁，少量懸浮生長，經(jīng)2～3 d可形成穩(wěn)定的細胞球，經(jīng)免疫熒光檢測Nestin染色陽性，證明是NSCs。NSCs培養(yǎng)5～7 d后即可傳代，傳代3～4次即可見到純度較高的NSCs。在本實驗中， 對所得NSCs進行一定的誘導，顯示NSCs可分化為表達NSE的神經(jīng)元和表達GFAP的星形膠質(zhì)細胞。

Wnt3a由352個氨基酸組成，是Wnt(Wingless-related MMTV integration site)基因家族成員中最早表達的一種蛋白，也是最重要的一種蛋白，在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中持續(xù)表達。Wnt3a主要通過激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路表達作用。Wnt3a與細胞膜上的受體Frizzled(Fz)和共受體低密度受體相關蛋白-6(Lrp6)結合，促使下游胞質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白糖原合成酶激酶失活，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 數(shù)量增多并進入細胞核，后者達到一定水平后進入細胞核，在胞核中β-catenin與轉錄因子家族TCF(T cell factor)/LEF(Lymphoid Enhancer Factor)形成復合體誘導靶基因的轉錄和表達，從而產(chǎn)生靶細胞的增殖、分化等一系列生物學效應[9]。

Wnt/β-catenin信號通路對NSCs的增殖具有明顯作用。體內(nèi)研究[10]顯示創(chuàng)傷性腦損傷后Wnt3a和β-catenin蛋白在損傷側皮層和海馬區(qū)的含量增加，這說明Wnt3a通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路促進神經(jīng)細胞的增殖，從而修復損傷的神經(jīng)組織。體外實驗也表明Wnt3a的表達上調(diào)時NSCs的增殖能力顯著提高[11]。本實驗結果顯示，不同處理組培養(yǎng)NSCs 48 h后，與sham組比較，隨著Wnt3a濃度的增加，NSCs相應的在450 nm處OD值增加；所處G1期比例降低，(S+G2)期比例升高；這表明Wnt/β-catenin信號通路激活后NSCs大量進入細胞周期，蛋白質(zhì)合成增加，物質(zhì)代謝活躍，處于分裂期的細胞比例提高，增殖能力越強。

Wnt/β-catenin信號通路對NSCs的定向分化具有明顯的調(diào)控作用，但是對于具體的分化方向目前還沒有統(tǒng)一的認識。有研究[12-13]表明，在體外胚胎大鼠海馬NSCs培養(yǎng)實驗中，在培養(yǎng)基中添加Wnt3a蛋白，同樣可增加分化神經(jīng)元的數(shù)量，而減少星形膠質(zhì)細胞分化的數(shù)量。還有研究[14]顯示，在體外NSCs培養(yǎng)過程中，加入Wnt3a蛋白可促進NSCs向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞的分化。但是還有一部分研究[15]表明Wnt3a在調(diào)節(jié)NSCs增殖的同時，將促進膠質(zhì)細胞分化的增多，并降低神經(jīng)元分化的比例，同時通過抑制Wnt3a信號通路的表達將有效增強NSCs向神經(jīng)元分化的比例。在本研究中，不同處理組培養(yǎng)NSCs 48 h后，用Western blot法檢測不同組別的NSE和GFAP的表達量，與sham組比較，Wnt3a組的NSE蛋白相對表達量明顯提高，GFAP蛋白相對表達量明顯降低。這表明Wnt3a可促進NSCs向神經(jīng)元的分化，抑制對星形膠質(zhì)細胞方向的分化，而且這一作用隨著Wnt3a含量的提高而加強。

綜上所述，本實驗成功獲得新生24 h小鼠海馬的NSCs，并可穩(wěn)定傳代；Wnt/β-catenin信號通路激活后促進NSCs增殖以及向神經(jīng)元的分化，這為NSCs應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防與治療提供了理論依據(jù)。