楊 莉，孫耕耘，秦一雨，葛安興

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，我國是肺癌大國，年新發(fā)病例數(shù)約占全球總數(shù)一半，并呈逐年上升趨勢[1]。近年來，手術(shù)、放化療等治療手段日益進(jìn)展，但肺癌整體療效并不理想[2]。研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對改善目前中晚期肺癌患者預(yù)后具有重大意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度大于200 bp、不編碼蛋白的RNA，通過多種途徑調(diào)控基因表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來LncRNA與腫瘤之間的關(guān)系逐漸受到重視，它們作為原癌基因發(fā)揮促癌作用，也能作為抑癌基因發(fā)揮抑癌作用[3-4]。該研究通過長鏈非編碼RNA芯片對肺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的LncRNA進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)HOXA遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本(HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP)基因表達(dá)顯著增高，并通過一系列細(xì)胞和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討HOTTIP對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料攜帶HOTTIP-shRNA、HOTTIP全長序列的慢病毒以及空白慢病毒購自上海伯豪生物科技有限公司；特異性HOTTIP原位雜交檢測試劑盒(HOTTIP RNAscope 2.0)購自美國Advanced Cell Diagnostic公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；TRIzol裂解液購自美國Sigma公司；PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自中國碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；所有抗體包括一抗和二抗均購自美國Santa Cruz公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；X-OMAT-Blue film購自美國Kodak公司。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本收集 收集銅陵市人民醫(yī)院胸外科行肺癌手術(shù)的80例肺癌患者，其中男52例，女28例；年齡 37～75歲，中位年齡64歲；肺癌腫塊切除后采用福爾馬林予以固定保存，同時切除腫塊周圍2 cm以外的癌旁組織作為對照組。所有80例患者均簽署了知情同意書和手術(shù)同意書。

1.2.2LncRNA芯片檢測 采用TRIzol提取3例肺癌組織及癌旁組織中的總RNA，然后送公司進(jìn)行LncRNA芯片檢測(美國Agilent公司)。該芯片可檢測41053條LncRNA和29417條mRNA。檢測結(jié)果采用Real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株95-D、A549和人永生化肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。三種細(xì)胞均采用添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃條件下5% CO2的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞生長至80%融合率時，采用0.25%胰酶消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代。

1.2.4慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 攜帶目標(biāo)LncRNA全長的慢病毒(Lenti-HOTTIP)和攜帶HOTTIP-shRNA的慢病毒(Lenti-HOTTIP-shRNA)由上海伯豪生物科技有限公司完成。在95-D和A549細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，將攜帶目標(biāo)基因的慢病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)孵育12 h。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染采用加入嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周。

1.2.5CCK-8法 96孔板中每孔接種2×103個95-D和A549細(xì)胞/100 μl過夜，然后加入慢病毒孵育，在孵育12 h后每孔加入10 μl體積的CCK-8溶液，并設(shè)計不加慢病毒的細(xì)胞作為對照組。加入CCK-8溶液孵育2 h后，放入酶標(biāo)儀中檢測溶液在450 nm的吸光度。細(xì)胞相對生長率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6Annexin V/PI實(shí)驗(yàn) Annexin V/PI實(shí)驗(yàn)按照BD公司提供的試劑盒進(jìn)行。收集至少1×105個經(jīng)慢病毒處理后的95-D和A549細(xì)胞，用70%預(yù)冷的乙醇固定30 min，然后分別加入Annexin V和PI，在黑暗的室溫下孵育15 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7Real-time PCR 采用TRIzol提取組織和細(xì)胞中的總RNA。首先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃、8 min預(yù)變性；95 ℃、10 s，65 ℃、18 s，72 ℃、16 s，共40個循環(huán)。U6作為內(nèi)參照。引物如下：miR-137：F: 5’-CCGGTGGTCCTCTGACTCTCTTCGGTGACGGGTATT-CTTGGGTGGA-3’;R: 5’-ATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGGAGAGTAC-3’；HOTTIP：F:5’-AATTCTGCCGCTGGTACTCTCCTCGACTACGCGTATTCTTAAGCAAT-3’； R: 5’-TAATCCGTATTATCCACCCAAGAATACCCGTCACCGAAGAGA-GTC-3’；U6：F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA;R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.8原位雜交實(shí)驗(yàn) 首先將肺癌和癌旁組織制成4 μm后的組織切片，每一張組織切片使用20 ul含有特異性HOTTIP探針的預(yù)處理液孵育12 h，然后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。染色評分采用陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與染色強(qiáng)度乘積的方法。根據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比例分為(0分,<5%; 1分, 5%～25%; 2分, 25%～50%; 3分, >50%)，根據(jù)染色強(qiáng)度分為(0分, 陰性; 1分, 弱陽性; 2分, 中等; 3分, 強(qiáng)陽性)。HOTTIP染色評分分級如下：- (0～1分)、+(2～3分)、(4～6分)、(>6分)。據(jù)此將HOTTIP表達(dá)水平分為兩組：HOTTIP低表達(dá)為(-)、(+)；HOTTIP高表達(dá)為()、()。

1.2.9Western blot法 總蛋白采用蛋白提取試劑盒完成。取25 μg蛋白樣品經(jīng)95 ℃水浴加熱變性后，加至SDS-PAGE膠中，然后按序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜(0.2 μm PVDF膜)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL化學(xué)發(fā)光、顯影定影。GAPDH蛋白作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1肺癌組織中LncRNA表達(dá)譜分析芯片結(jié)果顯示(圖1A)，肺癌組織和癌旁組織中共有127個LncRNA表達(dá)水平存在顯著差異，表達(dá)差異在2倍及以上的LncRNAs一共有22個。在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)的LncRNA有15個，表達(dá)下調(diào)的LncRNA有7個，其中HOTIIP在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)最為顯著，F(xiàn)C=6.37(表1)。通過Real-time PCR對80例肺癌組織中HOTIIP表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示HOTTIP在肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織(F=97.267，P<0.001)(圖1B)。

2.2HOTTIP與患者臨床病理因素之間的關(guān)系如圖2所示，原位雜交結(jié)果顯示HOTTIP主要位于細(xì)胞質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中染色強(qiáng)度和陽性率均顯著高于癌旁組織。高表達(dá)組52例，低表達(dá)組28例。通過χ2檢驗(yàn)分析，HOTTIP表達(dá)水平與性別、年齡、分化程度并無顯著關(guān)系，但它與腫瘤大小、TNM分期以及淋巴分期顯著相關(guān)。見表2。

2.3HOTTIP對肺癌細(xì)胞增殖的影響如圖3所示，HOTTIP在肺癌細(xì)胞株95-D和A549中的表達(dá)水平顯著高于人永生化肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B。HOTTIP過表達(dá)可以促進(jìn)95-D和A549細(xì)胞增殖，而沉默其表達(dá)則可以抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)。見表3、4。

2.4HOTTIP對肺癌細(xì)胞凋亡的影響在經(jīng)過慢病毒處理72 h后，HOTTIP過表達(dá)組細(xì)胞凋亡比例與對照組并無顯著差異，而HOTTIP表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞凋亡比例顯著增高(P<0.05)。見圖4。

2.5HOTTIP對增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，HOTTIP表達(dá)下調(diào)后(HOTTIP-shRNA)，95-D細(xì)胞內(nèi)p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)， Bax、斷裂的caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而HOTTIP過表達(dá)后，95-D細(xì)胞內(nèi)p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平不變。Bax、caspase-3、p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白條帶相對灰度值見表5。

表1 表達(dá)差異兩倍或兩倍以上的LncRNAs

圖1 肺癌和癌旁組織中HOTTIP表達(dá)水平

A：3例肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織芯片篩查熱圖；B：80例癌組織與癌旁組織的表達(dá)水平差異；與癌旁組織比較：***P<0.001

圖2 HOTTIP在癌組織和癌旁組織中的原位雜交染色 ×200

2.6HOTTIP與miR-137表達(dá)水平相關(guān)性分析通過miRDB軟件對HOTTIP與miR-137存在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩者存在結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。采用Real-time PCR檢測80例肺癌患者組織中miR-137表達(dá)水平，并與HOTTIP表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)為-0.412，P<0.001，提示兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(圖6B)。

表2 HOTTIP表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系(n=80)

3 討論

近年來多項(xiàng)研究顯示長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究首先通過芯片篩查發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(HOTTIP)在肺癌組織中表達(dá)異常增高，并通過Real-time PCR予以驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)HOTTIP不僅在肺癌組織中表達(dá)增高，而且其表達(dá)水平與某些臨床病理因素如腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)。已有研究[5-6]顯示HOTTIP在一些惡性腫瘤中存在表達(dá)增高的現(xiàn)象，如肝細(xì)胞癌、胰腺癌等。2017年Zhang et al[7]研究發(fā)現(xiàn)HOTTIP在肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，這與本課題組的研究結(jié)果相似。以上研究提示HOTTIP不僅參與肺癌發(fā)生發(fā)展，還可能成為診斷以及評估分期的標(biāo)志物。

目前HOTTIP被認(rèn)為具有原癌基因的特征，可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞增殖，其中包括肺癌[8]。在后續(xù)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中研究了HOTTIP對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果提示HOTTIP也參與調(diào)控肺癌細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的經(jīng)典信號通路[9]，研究[10]顯示PI3K信號通路在肺癌中處于異常激活狀態(tài)。本課題組發(fā)現(xiàn)HOTTIP處理后PI3K信號通路中的成員AKT和mTOR的磷酸化狀態(tài)出現(xiàn)增多，說明信號通路被激活，這可能是HOTTIP促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的重要原因。此外，本課題組還檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2及caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示HOTTIP-shRNA處理后，Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，而caspase-3活性片段表達(dá)升高，以上結(jié)果說明HOTTIP可以通過調(diào)控Bax/Bcl-2比例來影響細(xì)胞凋亡，但HOTTIP如何調(diào)控Bax/Bcl-2蛋白有待進(jìn)一步研究。

圖3 HOTTIP表達(dá)水平對肺癌細(xì)胞增殖的影響

A: HOTTIP在95-D、A549以及BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)水平；與BEAS-2B比較：*P<0.05；B: HOTTIP表達(dá)對95-D細(xì)胞增殖的影響；與Control組比較：△P<0.05；C: HOTTIP表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的影響；與Control組比較：#P<0.05

表3 95-D細(xì)胞OD值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、P值以及F值

表4 A549細(xì)胞OD值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、P值以及F值

圖4 HOTTIP表達(dá)水平對肺癌細(xì)胞凋亡的影響

A: 流式細(xì)胞儀檢測Annexin V/PI雙熒光；B:各處理組中95-D和A549細(xì)胞凋亡比例；與Control組比較：*P<0.05

圖5 HOTTIP對增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測及相關(guān)性分析

A: HOTTIP序列中存在miR-137結(jié)合位點(diǎn)；B: HOTTIP與miR-137表達(dá)水平相關(guān)性

表5 Bax、caspase-3、p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白條帶相對灰度值

LncRNA生物學(xué)作用方式多種多樣，既可以從轉(zhuǎn)錄水平也可以從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[11-12]。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)一種LncRNA調(diào)控基因表達(dá)的新途徑，就是LncRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)與miRNA相互結(jié)合，減弱miRNA對其他靶基因表達(dá)的抑制作用，并且這種作用方式通常只存在于細(xì)胞質(zhì)中[13]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)HOTTIP主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，提示HOTTIP可能也通過競爭性結(jié)合miRNAs發(fā)揮生物學(xué)作用。于是，本課題組通過軟件miRDB對HOTTIP可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示HOTTIP存在與miR-137結(jié)合的序列，本課題組進(jìn)一步檢測miR-137在肺癌中的水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與HOTTIP呈負(fù)相關(guān)。miR-137被認(rèn)為是一種抑癌基因，在多種腫瘤中包括肺癌表達(dá)下調(diào)，可以通過作用于多種靶基因如SRC3和TGFA而發(fā)揮抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的作用[14-15]。在今后的研究中，本課題組將通過雙熒光素酶報告基因檢測HOTTIP與miR-137的直接結(jié)合，并進(jìn)一步預(yù)測和驗(yàn)證miR-137的靶基因。