楊 琴，梁 楓，李正姐，賀志鵬， 黃超娟，丁楚涵，尹艷艷

圍絕經(jīng)期抑郁癥(perimenopausal depression disorder, PDD)是女性抑郁癥的常見類型，其典型表現(xiàn)為明顯抑郁，同時伴有焦慮緊張認知障礙等癥狀，給患者自身及家屬帶來極大的心理及生活困擾。目前臨床上多采用雌激素替代療法或雌激素聯(lián)合抗抑郁藥治療PDD，該方法雖療效肯定，但激素長期應(yīng)用的諸多禁忌及潛在致癌性迫切需求療效可靠、副作用小的治療藥物。PDD的發(fā)病原因比較復雜，外界環(huán)境刺激及體內(nèi)雌激素水平下降被認為是PDD的主要發(fā)病原因[1]。雌激素與相應(yīng)受體結(jié)合后通過基因與非基因效應(yīng)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達、影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成、促進神經(jīng)元生長、抑制神經(jīng)元凋亡及調(diào)控cAMP腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(cyclic adenosine monophosphate brain-derived neurotrophic factor，cAMP-BDNF)信號通路等機制發(fā)揮保護作用[2-3]。

雞豆黃素A(biochanian A, Bioch A)是一種大豆異黃酮類化合物，研究[4]表明Bioch A與雌二醇結(jié)構(gòu)相似性，可以與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素效應(yīng)，對激素引起的相關(guān)性疾病具有一定的保護作用。另外大量研究[5-7]發(fā)現(xiàn)Bioch A還具有抗炎、抗增殖、抗凋亡、抗腫瘤并且對阿爾茨海默病模型小鼠具有一定的緩解作用。但有關(guān)Bioch A對PDD的影響及機制研究未見報道。該研究采用目前公認的大鼠雙側(cè)卵巢摘除(ovariectomy，OVX)與慢性不可預知性溫和應(yīng)激[8](chronic unpre-dictable mild stress，CUMS)兩步法建立大鼠PDD模型，通過行為學、分子生物學等方法及手段，探討B(tài)ioch A對PDD模型大鼠的神經(jīng)保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，購自上海杰恩捷實驗動物有限公司。動物在溫度為(25±2) ℃，濕度<60%，光照時間為7:00～19:00 環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗前禁食12 h，不禁水。

1.2藥物及試劑Bioch A(純度98.2%)購自西安開來生物工程有限公司；氟西汀購自法國patheon公司；去甲腎上腺素(arterenol，NA)、多巴胺(dopamine，DA)及五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)標準品購自美國Sigma公司；抗白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)兔單克隆抗體、抗半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶-1(interleukin-1 converting enzyme，Caspase-1)兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)、磷酸化cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylation cAMP response element binding protein，p-CREB)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine protein kinase B，TrkB)抗體及兔抗BDNF抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化蛋白激酶A(phosphorylation protein kinase A， p-PKA)抗體購自美國CST公司；抗兔或抗鼠二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LunimataTMCrescendo發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.3PDD大鼠模型的制備及分組大鼠正常飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后開始造模，方法如下：用1%的戊巴比妥鈉(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，俯臥于手術(shù)臺，固定好腹部，用動物剃毛器將大鼠背部最末肋骨下方毛發(fā)剃凈，進行常規(guī)消毒后于鼠背最末肋骨下，距脊柱1.5～2.5 cm處切一小口，當看見乳白色的脂肪團時將其拉出體外進行分離，脂肪團中包裹有黃紅色呈細線狀不規(guī)則的組織即為卵巢。將卵巢下方輸卵管(包括脂肪)用細線結(jié)扎后剔除一側(cè)卵巢，同法剔除另一側(cè)卵巢。術(shù)后將剩余組織放回體內(nèi)，然后縫合肌肉皮膚并消毒。假手術(shù)組僅切除卵巢旁與卵巢同體積大小的脂肪組織。術(shù)后精心飼養(yǎng)，1周后將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、Bioch A(10、20、40 mg/kg)劑量組及氟西汀(2 mg/kg)陽性對照組，每組24只，分三批次完成，每次將各組大鼠分籠飼養(yǎng)。Bioch A和氟西汀用0.5%羧甲基纖維素鈉充分混勻，于每日應(yīng)激前1 h 灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等體積(1 ml/100 g)的羧甲基纖維素鈉灌胃，共計21 d。包括冰水游泳(4 ℃、5 min)，熱應(yīng)激(45 ℃、5 min)，搖晃(1次/s、15 min)，夾尾(將大鼠放入固定籠中，露出尾巴，用止血鉗夾住距尾根部1 cm處，持續(xù)1 min)，禁水24 h，禁食24 h，居住環(huán)境改變(潮濕墊料)等，各應(yīng)激因子按隨機方法在21 d內(nèi)應(yīng)用，每日給予1種刺激，每種刺激累計使用2～3次，使大鼠無法預料何種刺激發(fā)生，以此避免發(fā)生適應(yīng)性。CUMS見表1。

表1 CUMS

1.4行為學指標檢測

1.4.1曠場實驗(open filed test, OFT) 用一個80 cm×80 cm×40 cm的敞箱，地面由等大的25個方格組成，周圍為黑色材料制成，室內(nèi)為暗光。將大鼠放入反應(yīng)箱中央，攝像系統(tǒng)記錄動物在曠場內(nèi)6 min的行為學表現(xiàn)，計算水平運動(3或4只腳同在一個格內(nèi)計1分，穿越1格計1分，沿線行走每8 cm計1分)及垂直運動得分(大鼠站立次數(shù)，雙前足離地1次為1分)。兩只動物之間用75%酒精擦拭底部及四壁，避免對后面大鼠測試產(chǎn)生影響。實驗在應(yīng)激第22 天完成。

1.4.2強迫游泳實驗(force swimming test, FST) 將大鼠單獨置于水深20 cm的玻璃缸內(nèi)(高40 cm，直徑20 cm) ，水溫22～25 ℃，游泳6 min，觀察并記錄后4 min內(nèi)大鼠在水中累計不動時間的總和。每只大鼠實驗結(jié)束后洗凈水缸并換水，避免影響后面大鼠測試。實驗在應(yīng)激第22 天完成。

1.5大鼠海馬組織單胺類遞質(zhì)含量的測定行為學測試結(jié)束后第2天，斷頭處死大鼠，開顱取腦，在冰臺上迅速分離海馬組織，組織稱重后按每4 mg組織加1 ml含高氯酸0.1 mol/L和EDTA 0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。用玻璃組織勻漿器將組織勻漿，于4 ℃條件下離心20 min后取上清液，上清液用0.22 μm濾器過濾后上機檢測。單胺類遞質(zhì)經(jīng)分析柱分離后再經(jīng)電化學檢測器進行定量檢測，在色譜軟件工作站顯示并分析結(jié)果。通過標準品的保留時間和峰面積確定遞質(zhì)種類并計算遞質(zhì)濃度。

1.6Westernblot檢測大鼠IL-1β及Caspase-1、p-PKA、PKA、p-CREB、CREB、BDNF、TrkB表達低溫提取海馬總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加GAPDH(1 ∶2 000)、IL-1β(2 μg/ml)、Caspase-1(1 μg/ml)、p-PKA(1 ∶1 000)、PKA(1 ∶1 000)、p-CREB(1 ∶500)、CREB(1 ∶1 000)、BDNF(1 ∶1 000)及TrkB(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜。洗膜，滴加相應(yīng)二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進行拍照，用Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進行灰度值測量。將目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)或非磷酸化蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

表2 Bioch A對PDD 大鼠行為學的影響

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖1 Bioch A對PDD 大鼠海馬IL-1β及Caspase-1表達的影響

2 結(jié)果

2.1BiochA對PDD大鼠行為學的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠水平和豎直得分均明顯減少，強迫游泳不動時間顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組水平和豎直得分均明顯增加，而強迫游泳不動時間減少(F= 174.7、87.57、26.4，P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.2BiochA對PDD大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織DA、NA及5-HT的水平均明顯降低(F=34.63、58.16、42.07，P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬5-HT的水平均不同程度升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

2.3BiochA對PDD大鼠海馬IL-1β及Caspase-1表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬IL-1β、Caspase-1表達水平均明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬IL-1β、Caspase-1表達水平均不同程度降低(F=43.09、58.24，P<0.05,P<0.01)。見圖1。

表3 Bioch A對PDD 大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化的影響

與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖2 Bioch A對抑郁癥大鼠海馬PKA及CREB磷酸化水平的影響

2.4BiochA對PDD大鼠海馬PKA及CREB磷酸化水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬PKA及CREB蛋白磷酸化水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬PKA及CREB蛋白磷酸化水平均不同程度升高(F=177.6、164.0，P<0.05，P<0.01)。見圖2。

2.5BiochA對PDD大鼠海馬BDNF及TrkB表達的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬BDNF、TrkB 表達水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬BDNF、TrkB 表達水平均不同程度升高(F=140.6、62.59，P<0.05，P<0.01)。見圖3。

3 討論

本研究顯示與假手術(shù)組相比,模型組大鼠在曠場實驗中水平與垂直運動次數(shù)明顯減少，說明模型組大鼠活動度降低，對周圍新鮮環(huán)境的好奇性降低；模型組大鼠海馬組織DA、NA及5-HT的含量與假手術(shù)組相比均明顯降低，可見PDD 大鼠出現(xiàn)了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂，而與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組大鼠在礦場實驗中水平與垂直運動次數(shù)明顯增加，5-HT的水平均不同程度升高，提示Bioch A與氟西汀一樣能夠改善抑郁模型大鼠的行為，起到一定的抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)病機制非常復雜，目前認為5-HT等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的功能降低在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9-10]。而細胞因子可影響抑郁癥患者大腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的作用[11]，本研究顯示與假手術(shù)組相比模型組大鼠海馬中細胞因子IL-1β及Caspase-1表達水平均明顯升高，說明炎癥因子參與抑郁活動。研究[12-13]已證實神經(jīng)元再生比較集中的海馬顆粒細胞下層及其附近有磷酸化PKA及CREB的高表達，CREB不僅能增強海馬神經(jīng)元的整合和功能的可塑性，而且可直接調(diào)控BDNF的合成及轉(zhuǎn)錄。BDNF通過與其高親和力受體TrkB結(jié)合后對神經(jīng)元的生長、分化、存活及損傷后修復有重要的作用，并與長時程增強、學習、記憶有關(guān)[14]。實驗證實，氟西汀等抗抑郁藥均可激活腺苷酸環(huán)化酶，提高cAMP含量，上調(diào)cAMP-CREB功能，增加海馬BDNF、TrkB的表達[15]。上述研究表明，抗抑郁藥可以通過激活PKA，增強CREB的表達水平或磷酸化水平，進而介導BDNF的功能，促進海馬神經(jīng)元再生，可見cAMP-CREB-BDNF信號通路是抑郁癥神經(jīng)元再生關(guān)健性環(huán)節(jié)之一。本研究同時發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，模型組海馬組織PKA及CREB磷酸化明顯降低，同時BDNF及TrkB 表達水平不同程度降低；與模型組相比，不同劑量Bioch A和氟西汀均能上調(diào)海馬區(qū)PKA及CREB磷酸化水平，提高BDNF及TrkB表達水平。

圖3 Bioch A對PDD 大鼠海馬BDNF及TrkB表達的影響

綜上所述，Bioch A可能降低海馬IL-1β的含量，上調(diào)色氨酸羥化酶表達，促進5-HT的合成與釋放，進而通過G蛋白偶聯(lián)信號通路調(diào)節(jié)cAMP的活性，激活PKA進而磷酸化CREB，最終促進BDNF及TrkB的表達，促進海馬神經(jīng)元的再生而具有一定的抗抑郁作用。