向麗娟, 汪圣毅, 包楚陽(yáng), 張 焱, 韓 坤, 劉 虎,4

胃癌(gastric cancer,GC)是世界第五大惡性腫瘤和第三大常見(jiàn)癌癥死亡原因[1]。GC作為消化道腫瘤與營(yíng)養(yǎng)代謝密切相關(guān)。隨著脂質(zhì)組學(xué)分析在癌癥研究中取得的重要進(jìn)展，脂代謝(lipid metabolism，LM)異常與癌癥關(guān)系的研究日益受到關(guān)注[2-5]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的紐帶，是揭示疾病基因突變規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展重要機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)致病基因調(diào)控關(guān)鍵靶點(diǎn)等領(lǐng)域的最佳研究手段。該研究利用高通量測(cè)序?qū)C及癌旁組織的差異表達(dá)譜進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)富集分析，以期探索GC中LM相關(guān)通路的關(guān)鍵基因(key genes，KGS)，為GC診斷與治療從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)上尋找新的線索。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年4月7日～19日住院GC患者術(shù)后GC組織標(biāo)本8例及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本4例，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。其中男3例，女5例，年齡25～77(60.1±15.3)歲。病理顯示均為中-低分化腺癌，其中6例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但無(wú)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。TNM ⅠB～ⅡB期4例，ⅢA～ⅢC期4例。患者術(shù)前均未接受過(guò)化療、放療或生物治療等干預(yù)措施，無(wú)其他腫瘤病史，無(wú)糖尿病、高血壓、腎病、免疫系統(tǒng)疾病及上呼吸道感染等合并癥。癌及癌旁?xún)山M性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。標(biāo)本于術(shù)后0.5 h內(nèi)放入RNAlater(美國(guó)Invitrogen公司)保存液中，-20 ℃保存，正常對(duì)照來(lái)自手術(shù)邊界5 cm以上。所有患者簽署知情同意書(shū)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：20140141)。

1.2主要儀器與試劑瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司；NanoPhotometer?分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Implen公司；安捷倫2100生物分析儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；HiSeq Xten、TruSeq PE簇生成試劑盒v3-cBot-HS購(gòu)自美國(guó)Illumina公司； NEBNext?UltraTMRNA文庫(kù)制備試劑盒及Oligo d(T) 25磁珠購(gòu)自美國(guó)NEB公司；Qubit?2.0熒光計(jì)、Superscript II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司； 核酸純化試劑盒AMPure XP購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3cDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)檢① 按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，隨后質(zhì)控(樣品無(wú)污染時(shí)，RNA質(zhì)量≥1 μg，RNA完整性(RNA integrity number，RIN) ≥6.8；樣品有輕微污染時(shí)，RNA質(zhì)量≥2 μg，RIN≥6.8)；② 通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集mRNA，在NEBNext碎片緩沖區(qū)用二價(jià)陽(yáng)離子將mRNA隨機(jī)打斷；③ 將片段化mRNA為模板合成cDNA第一條鏈，隨后用核糖核酸酶H降解RNA鏈，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈；④ 末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP篩選150～200 bp的cDNA片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP進(jìn)行純化，最終獲得cDNA文庫(kù)；⑤ 使用Qubit 2.0熒光計(jì)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行初步定量，安捷倫2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，隨后qRT-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度高于2 ×10-9mol/L )，以保證文庫(kù)質(zhì)量。從而得到最終的cDNA文庫(kù)。

1.4上機(jī)測(cè)序根據(jù)制造商的說(shuō)明，利用TruSeq PE簇生成試劑盒v3-cBot-HS 生成簇，然后在HiSeq Xten平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙端150 bp測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理經(jīng)過(guò)測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查及原始數(shù)據(jù)(raw read)過(guò)濾，獲得后續(xù)待分析數(shù)據(jù)(clean reads)，采用STAR(v2.5.1b)軟件對(duì)獲得的clean reads進(jìn)行比對(duì)分析，使用HTSeq(v0.6.0)進(jìn)行基因水平定量分析，RSEM(v1.2.28)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本水平的定量分析。采用edgeR(v3.12.1)軟件進(jìn)行表達(dá)差異顯著性分析，將q (多重假設(shè)檢驗(yàn)校正的P值)<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用clusterProfiler(v3.0.5)軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行KEGG通路富集分析，將q<0.05為富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，篩選出與胃癌相關(guān)的脂代謝通路。

2 結(jié)果

2.1mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建采用TRIzol法提取的GC和癌旁正常組織的總RNA的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)都基本達(dá)標(biāo)，然后用Oligo磁珠分離出mRNA，合成雙鏈cDNA文庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，上機(jī)測(cè)序。

2.2RNA-seq數(shù)據(jù)處理將構(gòu)建文庫(kù)用HiSeq Xten進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的雙端測(cè)序，為了保證信息分析數(shù)據(jù)質(zhì)量，將12個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和比對(duì)分析。clean reads均占相應(yīng)raw reads的90%以上， Q20≥94%， Q30≥88%(Q為20和30分別代表堿基測(cè)序錯(cuò)誤率為0.01和0.001，Q20和Q30分別表示質(zhì)量值大于20和30的堿基占總堿基的百分比)。質(zhì)量控制合格，后續(xù)分析都基于高質(zhì)量的clean reads。然后對(duì)RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析、基因水平定量及標(biāo)準(zhǔn)化處理。有91%～95%的reads可以比對(duì)到人類(lèi)參考基因組上，兩組的唯一比對(duì)率66%～93%。

2.3差異表達(dá)分析根據(jù)以上判斷標(biāo)準(zhǔn)，利用edgeR軟件篩選差異基因。將q<0.05作為GC和癌旁正常組織差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。一共檢測(cè)出差異表達(dá)基因3 198個(gè)。與正常胃黏膜相比，GC中表達(dá)上調(diào)基因共1 776個(gè)，下調(diào)基因共1 422個(gè)?；鹕綀D表明了GC癌組織和正常組織間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)基因分布情況，見(jiàn)圖1，上調(diào)基因用紅點(diǎn)表示，下調(diào)基因用綠點(diǎn)表示, PC表示癌旁組，DEG表示差異表達(dá)基因。差異倍數(shù)(fold change)表示基因在癌組織與正常組織間表達(dá)倍數(shù)變化，根據(jù)差異分析軟件中的收縮模型計(jì)算得到。

圖1 胃癌與正常胃黏膜差異表達(dá)基因火山圖

2.4差異表達(dá)KEGG分析進(jìn)一步行KEGG 富集分析，評(píng)估差異表達(dá)基因涉及的生物途徑。結(jié)果表明，共映射到215種不同的代謝通路上。其中顯著富集的途徑是蛋白質(zhì)的消化與吸收，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，精氨酸和脯氨酸代謝，粘著斑，脂肪的消化與吸收，胃酸分泌，見(jiàn)表1。

2.5脂肪消化與吸收代謝通路的關(guān)鍵基因脂肪的消化與吸收代謝通路中有18個(gè)基因顯著差異表達(dá)，其中14個(gè)上調(diào)和4個(gè)下調(diào)，見(jiàn)表2。代謝通路圖見(jiàn)圖2。將基因差異倍數(shù)|fold change|>2作為進(jìn)一步篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到9個(gè)上調(diào)基因和2個(gè)下調(diào)基因，可能為脂代謝相關(guān)通路的潛在KGS。

表1 GC和正常組織差異表達(dá)基因的KEGG顯著富集通路(q <0.05)

表2 脂肪消化與吸收代謝通路顯著上調(diào)或下調(diào)基因

3 討論

自從癌癥被提出是一種代謝異常性疾病以來(lái)，已有諸多研究[6-8]探索對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的特定生化代謝途徑。脂質(zhì)具有多種重要的生物學(xué)功能，脂質(zhì)譜系變化及LM異常在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著十分重要的作用[4, 9]。

KEGG是一個(gè)用于從基因組和分子水平了解生物系統(tǒng)高級(jí)功能和效用的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，它能通過(guò)圖形來(lái)表示細(xì)胞內(nèi)代謝、膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)周期等生物學(xué)過(guò)程。該研究對(duì)GC差異表達(dá)基因行KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)LM通路中脂肪的消化與吸收代謝通路顯著富集。

脂質(zhì)的消化吸收分為膽汁酸鹽協(xié)助脂質(zhì)消化酶消化脂質(zhì)和吸收的脂質(zhì)經(jīng)再合成進(jìn)入血液循環(huán)兩部分。脂質(zhì)消化產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈脂肪酸、2-甘油一酯、膽固醇和溶血磷脂等，在小腸進(jìn)入腸黏膜細(xì)胞后需要單酰甘油-O-?；D(zhuǎn)移酶3(monoacylglycerol O-acyltransferase 3，MOGAT3)、脂肪酸結(jié)合蛋白2(fatty acid binding protein 2，F(xiàn)ABP2)、載脂蛋白A4(apolipoprotein A4，APOA4)、NPC1樣細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1)等協(xié)助合成乳糜微粒，進(jìn)而被腸黏膜細(xì)胞分泌，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)。而該研究中合成這些蛋白的基因高表達(dá)，提示吸收的脂質(zhì)再合成途徑未影響GC患者脂質(zhì)的消化與吸收，而主要是脂質(zhì)消化酶的低表達(dá)起了主導(dǎo)作用。

圖2 脂肪消化與吸收的代謝通路圖紅色表示基因上調(diào)，綠色表示基因下調(diào)；其中Lipase中包括PLA2G1B、PLA2G2A、PLA2G12B、PLA2G12A、LIPF

脂肪酶F，胃型 (lipase F，gastric type，LIPF)是最顯著下調(diào)的基因，它編碼的胃脂肪酶參與胃腸道中膳食甘油三酯的消化；其表達(dá)下調(diào)可嚴(yán)重影響機(jī)體對(duì)脂肪的存儲(chǔ)。而脂肪存儲(chǔ)障礙是引起癌癥惡病質(zhì)的重要因素之一。因此，LIPF可能與癌癥惡病質(zhì)的發(fā)生緊密相關(guān)。

由磷脂酶A2組IIA(phospholipase A2 group IIA，PLA2G2A)編碼的蛋白質(zhì)是磷脂酶a2家族的成員，它催化磷酸甘油酯的sn-2脂肪酸?；ユI的水解，并且被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)生物膜中的磷脂代謝。有研究[10]顯示PLA2G2A在GC細(xì)胞質(zhì)中顯著表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤大小、分化程度及分期相關(guān)，是GC患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。體外實(shí)驗(yàn)顯示它的敲除能增加GC對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。該研究顯示PLA2G2A在GC中上調(diào)，這與以前的研究結(jié)果一致，提示PLA2G2A可能成為GC診斷、治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)。另外，PLA2G2A的過(guò)表達(dá)與直腸癌、肺癌的預(yù)后也相關(guān)[4, 12]，并且可能參與前列腺癌的進(jìn)展[13]。

PLA2G4A為花生四烯酸生成途徑的限速酶，而花生四烯酸代謝途徑與胃腸癌炎癥相關(guān)腫瘤的發(fā)生相關(guān)。這提示PLA2G4A在胃腸癌的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Zhang et al[14]發(fā)現(xiàn)與非癌組織相比，GC中PLA2G4A的表達(dá)顯著降低， 它的降低與GC患者的不利生存相關(guān)。而該研究卻顯示PLA2G4A在GC組高表達(dá)。有研究[5]顯示PLA2G4A在乳腺癌中也高表達(dá)，與其不良預(yù)后相關(guān)。此外，PLA2G4A過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲[2]。各種癌癥中都報(bào)道了FABP1的過(guò)表達(dá)，并能促進(jìn)腫瘤血管生成和遷移[9]。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員5(ATP binding cassette subfamily G member 5，ABCG5)編碼的蛋白質(zhì)作為半轉(zhuǎn)運(yùn)體可以限制腸吸收并促進(jìn)膽固醇的膽汁排泄，其高表達(dá)可能與GC患者的吸收功能缺陷有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)脂肪的消化與吸收代謝通路的分析顯示LIPF、PLA2G2A、PLA2G4A、FABP1及ABCG5可作為GC診斷與治療的候選生物標(biāo)志物。本研究為探明GC脂質(zhì)代謝改變機(jī)制提供了線索，有利于監(jiān)控代謝異常和及早干預(yù)惡病質(zhì)的發(fā)生，延長(zhǎng)患者生存期和提高生活質(zhì)量。