沈 帆，程文慧，范一菲，沈 兵，鐘明奎

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)產(chǎn)生原因是睡眠時(shí)上氣道塌陷阻塞，從而導(dǎo)致呼吸暫停與通氣不足，進(jìn)而引起打鼾、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂、血氧飽和度下降頻發(fā)和白天嗜睡等一些癥狀，是多種心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是造成患者致殘和死亡的主要原因。OSA可產(chǎn)生多種危害，如間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)、高碳酸血癥、胸內(nèi)負(fù)壓劇烈波動(dòng)、睡眠中斷和結(jié)構(gòu)紊亂，其中IH是OSA的主要病理生理學(xué)特點(diǎn)和損傷機(jī)制，被認(rèn)為是引起心血管疾病的最為重要的因素[1]。組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDAC)將乙酰基團(tuán)從組蛋白或者非組蛋白上的ε-N-乙酰賴(lài)氨酸中去除掉，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性水平的一類(lèi)酶家族。HDAC是表觀(guān)遺傳調(diào)控子，調(diào)控了組蛋白乙?；叭ヒ阴；乃礁叩汀⒑巳旧|(zhì)的構(gòu)象變化、組蛋白和DNA之間相互作用、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾等。研究[2]表明HDAC在心血管疾病的發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，保護(hù)心血管的重要途徑之一便是抑制HDAC，所以抑制HDAC可能對(duì)心血管疾病的診斷以及治療是一種全新的方案[3]。該研究將探討間歇性低氧引起的小鼠心肌損傷是否可以通過(guò)HDAC抑制劑SAHA予以保護(hù)及其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性昆明小鼠，18～23 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，通風(fēng)良好，室溫 18～25 ℃。

1.2儀器和試劑測(cè)氧儀(CYS-1 型，南京新飛分析儀器制造有限公司)；醫(yī)用壓縮氧氣(濃度>99.9%)、壓縮氮?dú)?濃度>99.99%)由合肥眾益化工產(chǎn)品有限公司充裝；Vorinostat(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，用溶媒將SAHA配制成5 mg/ml，配置好后立即使用，溶媒的配比方案為ddH2O+30% PEG300+5% Tween 80+2% DMSO；Dihydroethidium(DHE)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1間歇性低氧模型的制備和分組 小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成正常氧組(Sham組)、間歇性低氧組(IH組)、正常氧SAHA干預(yù)組(Sham+SAHA組)及間歇性低氧SAHA干預(yù)組(IH+SAHA組)，每組7只。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前研究出的方案，使用氮?dú)獠粩喑淙腴g歇性低氧箱內(nèi)，稀釋低氧箱內(nèi)氧氣[4]，將IH組以及IH+SAHA組小鼠放進(jìn)低氧倉(cāng)內(nèi)，進(jìn)行每天8 h的間歇性低氧處理，處理時(shí)間一共連續(xù)4周。Sham組和Sham+SAHA組除不充入氮?dú)夂脱鯕馔?，其余均與IH 組相同處理。在間歇性低氧處理2周之后，Sham+SAHA組以及IH+SAHA組連續(xù)2周每天使用SAHA 50 mg/(kg·d)給予腹腔注射，而Sham組和IH組腹腔則注射相同體積溶媒。實(shí)驗(yàn)第4周末，處死小鼠，計(jì)算小鼠心臟指數(shù)，HE染色和VG染色觀(guān)察心臟病理形態(tài)學(xué)改變，DHE染色觀(guān)察小鼠心肌中活性氧物(reactive oxygen species,ROS)含量。

1.3.2心臟重量指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽渫瓿珊笫紫冉o小鼠測(cè)量體重。再使用10%水合氯醛用腹腔注射的方法麻醉小鼠，注射劑量是0.05 ml/10 g，再使用眼球摘除取血的方法，獲取各組小鼠的血液。取血之后，在迅速使用粗剪刀剖開(kāi)小鼠的胸腔，剪下小鼠心臟與胸主動(dòng)脈。心臟剪下之后，去除附著的結(jié)締組織，并且將粘在心臟上的細(xì)小脂肪以及殘留的血液在生理鹽水中輕輕擺動(dòng)去除，并將心臟用濾紙完全吸干之后再稱(chēng)量重量，并且用直尺測(cè)得小鼠的脛骨長(zhǎng)度，計(jì)算得出心臟重量/體質(zhì)量(mg/g)以及心臟重量/脛骨長(zhǎng)度(mg/cm)的比值。

1.3.3心臟組織學(xué)觀(guān)察 小鼠的心臟被洗凈吸干水后，首先使用10%多聚甲醛對(duì)其進(jìn)行灌流，之后放在多聚甲醛溶液中固定，在經(jīng)脫水機(jī)脫水之后，用石蠟包埋機(jī)包埋成蠟塊。使用石蠟切片機(jī)將心臟蠟塊標(biāo)本切成4 μm薄片，用毛筆蘸到溫水中展開(kāi)，之后使用載玻片撈出，之后將其用90 ℃烤20 min進(jìn)行脫蠟，再分別使用HE和VG膠原染色，最后使用樹(shù)脂封片，并用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察和拍攝。拍攝所得圖像使用Image J軟件計(jì)算心肌細(xì)胞的橫截面積。

1.3.4心臟中ROS的測(cè)定 將新鮮心臟取出，OTC包埋液氮冷凍后置-80 ℃冰箱保存。用冰凍切片機(jī)(Leica，德國(guó))將冷凍后的標(biāo)本切成5 μm的切片，用 PBS 洗滌，將配好的ROS探針DHE(5 μmol/L)在37 ℃烘箱內(nèi)與標(biāo)本在避光濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min。DHE 在超氧化物生成處被氧化成為溴化乙錠，與 DNA 相結(jié)合之后，激發(fā)出紅色的熒光，可以通過(guò)觀(guān)察熒光的強(qiáng)度檢測(cè)ROS含量。

2 結(jié)果

2.1SAHA對(duì)間歇性低氧小鼠心臟肥大的影響使用小鼠的心臟重量/體質(zhì)量、心臟重量/脛骨長(zhǎng)度的比值和心肌細(xì)胞橫截面積對(duì)心肌肥大進(jìn)行評(píng)價(jià)。四組小鼠心臟重量/體質(zhì)量比值[F(3，24) =58.52，P<0.001]、心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值[F(3，24) =14.35，P<0.001]存在明顯差異。和Sham組相比，IH組小鼠心臟重量/體質(zhì)量比值與心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值顯著增加(P<0.001)，出現(xiàn)了心臟肥大。使用SAHA處理1周后，和IH組相比，IH+SAHA組的小鼠心臟重量/體質(zhì)量比值與心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值下降明顯(P<0.01)，提示IH小鼠心肌肥大可被SAHA抑制；SAHA對(duì)Sham組小鼠心臟重量/體質(zhì)量和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值沒(méi)有影響(圖1)。

圖1 SAHA對(duì)間歇性低氧小鼠心臟重量的影響

A：心臟重量/體質(zhì)量比值；B：心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值；與Sham組比較：***P<0.001；與IH組比較：##P<0.01

HE染色結(jié)果顯示，四組小鼠心肌橫截面積存在明顯差異[F(3，186)=55.58，P<0.001]。與Sham組相比，IH組小鼠心臟的心肌細(xì)胞橫截面積顯著增加(P<0.001)；SAHA可降低間歇性低氧引起心肌細(xì)胞橫截面積的增加(P<0.01)，但Sham組小鼠沒(méi)有影響(圖2)。

圖2 SAHA對(duì)間歇性低氧小鼠心肌細(xì)胞橫截面積的影響 ×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組；E：心肌橫截面積半定量分析的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；與Sham組比較：***P<0.001；與IH組比較：##P<0.01

2.2SAHA對(duì)間歇性低氧實(shí)小鼠心肌纖維化的影響VG染色結(jié)果顯示：與Sham組相比，IH組小鼠心肌膠原纖維明顯增多(棕黃色細(xì)胞)，SAHA治療顯著改善了IH組小鼠心臟纖維化；Sham小鼠無(wú)論是否應(yīng)用SAHA，心肌均未出現(xiàn)纖維化(圖3)。

2.3SAHA間歇性低氧小鼠心肌中ROS的影響DHE熒光染色結(jié)果顯示：與Sham組相比，IH組小鼠心肌中活性氧明顯增加，SAHA治療可顯著抑制IH小鼠ROS水平；SAHA對(duì)Sham組小鼠心肌ROS水平?jīng)]有影響(圖4)。

3 討論

本研究顯示間歇性低氧4周后，小鼠心臟重量/體質(zhì)量和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌膠原纖維沉積及心肌ROS顯著增加，提示間歇性低氧可引起心肌重構(gòu)及氧化應(yīng)激；應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA干預(yù)可明顯改善間歇性低氧引起的心肌損傷及ROS增加。本研究結(jié)果表明組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA可以改善間歇性低氧小鼠的心肌損傷狀況，其可能機(jī)制是抑制了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 SAHA對(duì)間歇性低氧小鼠心肌細(xì)胞纖維化的影響×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組

圖4 SAHA對(duì)間歇性低氧小鼠心肌細(xì)胞ROS的影響 ×400

A:Sham組；B：Sham+SAHA組；C：IH組；D：IH+SAHA組

心臟重構(gòu)是心臟對(duì)各種心血管疾病中出現(xiàn)的有害刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，但長(zhǎng)期重塑常導(dǎo)致慢性心力衰竭或心源性猝死。 因此，控制心肌重構(gòu)的進(jìn)程十分重要。許多研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑，特別是HDAC在心臟基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。目前已有18種進(jìn)化保守的哺乳動(dòng)物HDAC被鑒別出來(lái)，并且可分成四類(lèi)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，依據(jù)是系統(tǒng)發(fā)育的保守性。此外，已發(fā)現(xiàn)多達(dá)1 750個(gè)HDAC的非組蛋白靶蛋白，一些很重要的細(xì)胞生理過(guò)程則通過(guò)此類(lèi)非組蛋白的乙?；腿ヒ阴；M(jìn)行調(diào)節(jié)，比如細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架重組、內(nèi)吞作用與囊泡運(yùn)輸[5]。由于HDAC活性在生理和病理過(guò)程中至關(guān)重要，HDAC抑制劑已被開(kāi)發(fā)為多種疾病的治療選擇，如癌癥、情感障礙和艾滋病等[6]。HDAC抑制劑按結(jié)構(gòu)可分為四類(lèi)：短鏈脂肪酸(丁酸鹽、丁酸苯酯和丙戊酸)、異羥肟酸鹽(SAHA和TSA)、氨基苯甲酰胺(FK-228)和環(huán)肽。SAHA是光譜HDAC抑制劑，可抑制I類(lèi)和II類(lèi)HDAC活性，是首個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為HDAC抑制劑的臨床用藥，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤[6]。近些年有研究報(bào)道， SAHA、TSA以及丙戊酸等等一類(lèi)HDAC抑制劑可以防止由幾類(lèi)不同因素導(dǎo)致的心臟肥大[7-9]，有希望成為治療心臟肥厚和與之有關(guān)疾病的新藥物方案。

反復(fù)間歇性低氧可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇與活性氧物質(zhì)增加，與OSA導(dǎo)致的并發(fā)癥緊密有關(guān)[10]，在心肌重構(gòu)的過(guò)程中ROS依賴(lài)性途徑有很重要的影響[11]。ROS引起生物作用主要是通過(guò)導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)非特異性的氧化損傷或者影響特定的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。ROS細(xì)胞內(nèi)主要來(lái)自線(xiàn)粒體電子傳遞鏈與氧化酶，與ROS代謝相關(guān)的酶主要包含NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶與一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)以及過(guò)氧化氫酶(CAT)等，其中NADPH氧化酶在心臟重構(gòu)病理過(guò)程中起到相當(dāng)關(guān)鍵的作用[11]。此次研究使用SAHA抑制了間歇性低氧小鼠心臟ROS的增加與心肌重構(gòu)，其原因是否與NADPH氧化酶相關(guān)需要下一步的研究。