楊起賀，楊 浩，高 鵬，榮富龍，李叔偉

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

1 材料與方法

1.1 供試材料

哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司重組禽流感病毒H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2）滅活疫苗。

抗體監(jiān)測(cè)試劑：禽流感H5N1 Re-11株和Re-12以及H7N9Re-2株抗原及陽性血清，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，1%紅細(xì)胞懸液由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司質(zhì)量管理部提供的SPF級(jí)公雞紅細(xì)胞。

1.2 試驗(yàn)雞群

黑龍江省哈爾濱市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)量蛋雞1 500只，正常免疫雞群900只，300只不免疫重組禽流感病毒H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗，300只做應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫劑量及方法

首免：15日齡，免疫劑量0.3 mL·羽-1，頸部皮下注射。二免：45日齡，免疫劑量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。三免：75日齡，免疫劑量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。四免：100日齡，免疫劑量0.5 mL·羽-1，肌肉注射。

1.4 血樣采集

15日齡免疫前先測(cè)定基礎(chǔ)抗體，然后于29日齡（首免后2周）、36日齡（首免后3周）、43日齡（首免后4周）、52日齡（二免后1周）、59日齡（二免后2周）、66日齡（二免后3周）、73日齡（二免后4周）、82日齡（三免后1周）、89日齡（三免后2周）、 97日齡（三免后3周）、104日齡（三免后4周）、111日齡（三免后5周）、117日齡（四免后1周），每次分別每組采集10份血樣，離心制備血清并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紅細(xì)胞血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）檢測(cè)抗體。

1.5 檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法

試驗(yàn)均用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）進(jìn)行抗體檢測(cè)，待檢血清HI抗體滴度≥4log2時(shí)為抗體合格。

1.6 安全實(shí)驗(yàn)

首次免疫15日齡接種H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗后，每天測(cè)定雞的體重。免疫接種后連續(xù)觀察20 d，記錄疫苗接種部位和全身反應(yīng)。

1.7 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

將300只雞分為5組，每組60只，A組15日齡接種0.3 mL，B組15日齡接種0.5 mL，C組75日齡接種0.5 mL，D組75日齡接種0.8 mL，F(xiàn)組75日齡接種1 mL。接種后通過吸收時(shí)間，精神狀態(tài)，采食量觀察不同劑量H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗對(duì)雞群的應(yīng)激情況。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫后各毒株抗體效長(zhǎng)規(guī)律

免疫后各毒株抗體效長(zhǎng)規(guī)律見表1。

表1 免疫后各毒株抗體效長(zhǎng)規(guī)律

結(jié)果表明，蛋雞開產(chǎn)前選擇H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗進(jìn)行3次免疫，首免15日齡，二免45日齡，三免75日齡，選擇在不同日齡對(duì)雞群進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，首次免疫14 d后抗體滴度＞5 log2，59日齡也就是二免14日齡后，H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9Re-2抗體滴度均＞8 log2，對(duì)雞群有很好的保護(hù)作用。

2.2 接種疫苗后雞體重變化

接種疫苗后雞體重變化見表2。

結(jié)果表明，免疫組與對(duì)照組的體重基本保持一致，差異不顯著（P＞0.05），疫苗的接種并不影響雞的體重的增長(zhǎng)。注射疫苗后疫苗接種組和沒有接種疫苗組雞群的精神狀態(tài)無顯著差異（P＞0.05），免疫雞精神食欲良好，無不良反映，證明本疫苗是安全的。

2.3 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

應(yīng)激實(shí)驗(yàn)見表3。

結(jié)果表明，不同日齡的雞群接種不同劑量的重組禽流感病毒H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗（H5 N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2），從完全吸收時(shí)間、精神狀態(tài)、采食量方面來評(píng)價(jià)接種疫苗后對(duì)雞群應(yīng)激狀況，接種最大劑量1 mL時(shí)，疫苗對(duì)雞群應(yīng)激影響是一過性的，2～3日齡可以恢復(fù)。由于是臨床上飼養(yǎng)的雞群，飼養(yǎng)管理、溫度、濕度等都會(huì)對(duì)雞群造成一定的影響，疫苗回溫也會(huì)對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生影響，建議疫苗回溫時(shí)間1.5～2 h。

表2 接種疫苗后雞體重變化

表3 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

3 討論

3.1 抗體滴度消長(zhǎng)規(guī)律

對(duì)于蛋雞，本試驗(yàn)選擇15、45、75日齡進(jìn)行3次免疫，首次免疫后14日齡H5 Re-11、H5 Re-12、H7Re-2抗體滴度＞4log2，對(duì)雞群有保護(hù)力，二次免疫后14日齡H5 Re-11、H5 Re-12、H7Re-2抗體滴度＞8log2，說明對(duì)蛋雞有較好的保護(hù)力。

2019年高致病性禽流感發(fā)生率較高，死亡率低，這反而給養(yǎng)殖戶帶來的損失要大一些，原因是由于死亡率低，養(yǎng)殖戶對(duì)高致病性禽流感重視程度不夠[1]。由于時(shí)間和條件所限，本試驗(yàn)沒有在開產(chǎn)前進(jìn)行第4次免疫，實(shí)際在現(xiàn)地預(yù)防禽流感時(shí)，建議開產(chǎn)前免疫4次高致病性禽流感疫苗，這樣對(duì)開產(chǎn)前和產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞都會(huì)有較好的保護(hù)力，來預(yù)防高致病性禽流感的發(fā)生。

3.2 疫苗安全性

養(yǎng)殖戶往往對(duì)禽流感疫苗的應(yīng)激反應(yīng)有所顧忌，尤其是在蛋雞開產(chǎn)后擔(dān)心加強(qiáng)接種高致病性禽流感疫苗會(huì)影響蛋雞的產(chǎn)蛋率[2]。本試驗(yàn)通過安全性試驗(yàn)和疫苗接種的應(yīng)激反應(yīng)觀察，沒有明顯異常，說明重組禽流感病毒H5+H7亞型三價(jià)滅活疫苗對(duì)雞群沒有應(yīng)激作用，安全性高。