程民,陳穩(wěn),毛菊,楊雯雯,徐婷娟,沈國棟,吳新春,胡世蓮

[中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)，安徽省老年醫(yī)學研究所，腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室,合肥 230001]

呼吸道、消化道等黏膜組織中存在著大量的“共生菌”，共生菌在維持腸道、肝臟及肺臟等組織器官免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮極其重要的作用，共生菌群改變與感染性疾病、腫瘤、哮喘及遺傳性過敏癥等易感性密切相關。趨化因子配體24(CCL24)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)等細胞因子在機體免疫調節(jié)、免疫應答、器官發(fā)育及代謝等過程中發(fā)揮重要作用，共生菌群對機體CCL24、IGF-1表達水平的調控是值得研究的科學問題，本研究通過檢測小鼠外周血、肺臟、肝臟中CCL24及IGF-1的表達情況，進而探討共生菌群對上述因子表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級)購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，22 ℃、55%濕度、12 h晝/夜節(jié)奏條件下飼養(yǎng)。小鼠的飼養(yǎng)和實驗操作過程遵循中國科學技術大學實驗動物管理規(guī)范條例執(zhí)行。

1.1.2 抗菌藥物 萬古霉素、新霉素、氨芐青霉素和甲硝唑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 組織勻漿試劑 PBS磷酸鹽緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司，TritonX-100溶液購自生工生物工程股份有限公司，蛋白酶抑制劑購自Roche公司。

1.1.4 ELISA試劑盒 Mouse IGF-1 ELISA kit購自RayBiotech公司，Eotaxin-2 (CCL24) mouse ELISA kit購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 共生菌缺失小鼠的構建 使用含有組合抗菌藥物的飲用水連續(xù)飼喂C57BL/6小鼠4～6周，構建共生菌缺失小鼠模型[1]。飼喂期間觀測小鼠體質量變化、活動狀態(tài)等，對體質量降低嚴重(下降超過30%)的小鼠進行安樂死。實驗過程中設立對照組，使用不含抗菌藥物的飲用水進行飼喂。

1.2.2 勻漿緩沖液配制 取PBS溶液20 mL(pH值：7.25)，加入蛋白酶抑制劑混合片2片，TritonX-100溶液20 μL，振蕩混勻至蛋白抑制劑完全溶解，冰上放置，備用。

1.2.3 血清標本獲取 取實驗組與對照組小鼠各6只，摘除眼球取血，收集血液至1.5 mL無菌Ep管中，4 ℃放置3～4 h，之后3 000 r/min，4 ℃，離心10 min，將上清液(血清)轉移至0.5 mL無菌Ep管中。

1.2.4 組織勻漿液制備 上述小鼠(1.2.3中小鼠)摘眼球取血后，脫臼處死，解剖小鼠，小心分離肺臟、肝臟組織，去除血液、殘余血管及結締組織后，稱重。肝臟、肺臟組織按100 mg∶300 μL的比例加入相應體積的勻漿緩沖液，并在無菌玻璃勻漿器中進行勻漿，將勻漿液移入 1.5 mL 無菌Ep管中，3 000 g，4 ℃，離心 10 min。吸取上清液，分裝至0.5 mL無菌EP管中，-80 ℃保存，備用。

1.2.5 CCL24及IGF-1蛋白濃度檢測 利用ELISA方法按照試劑盒說明書方法檢測小鼠血清、肝臟及肺臟組織勻漿液中CCL24與IGF-1蛋白的濃度，每個樣品設3個重復孔。

2 結果

2.1 血清、肺臟、肝臟組織中CCL24的表達情況 結果顯示，共生菌缺失小鼠血清、肺臟及肝臟組織勻漿中CCL24的濃度分別為(1.509±0.119)μg/L、(14.626±0.769)ng/g、(8.704±0.458)ng/g，正常小鼠血清、肺臟及肝臟組織勻漿中CCL24的濃度分別為(1.018±0.043)μg/L、(11.984±0.683)ng/g、(11.575±0.609)ng/g。兩組各項指標比較，P均<0.05(圖1)。

注：WT為正常小鼠，Abx為共生菌缺失小鼠；** P<0.01，*P<0.05

2.2 血清、肺臟、肝臟組織中IGF-1的表達情況 共生菌缺失小鼠血清、肺臟及肝臟組織勻漿中IGF-1的濃度分別為(1.250±0.066)μg/L、(1.290±0.031)ng/g、(1.112±0.027)ng/g，正常小鼠血清、肺臟及肝臟組織勻漿中IGF-1的濃度分別為(1.240±0.019)μg/L、(0.998±0.024)ng/g、(2.989±0.073)ng/g。共生菌缺失小鼠血清中IGF-1蛋白的表達水平與正常小鼠血清相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)、肺臟組織勻漿中IGF-1蛋白的水平明顯高于正常小鼠肺臟組織勻漿(P<0.05)，但共生菌缺失小鼠肝臟組織勻漿中IGF-1的濃度卻明顯低于正常小鼠(P<0.01)(圖2)。

注：WT為正常小鼠，Abx為共生菌缺失小鼠；** P<0.01，*P<0.05

3 討論

呼吸道、消化道、泌尿生殖道、皮膚等黏膜組織中存在著大量的微生物，這些對人體有益的微生物被稱為“共生菌”。共生菌在維持黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，共生菌與免疫系統(tǒng)之間存在錯綜復雜的關系與精妙的平衡[2-3]。共生菌在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮至關重要的調控作用，可以調控免疫細胞的活性，并能刺激腸黏膜上的淋巴組織的發(fā)育。肝臟因與腸道特有的解剖學位置關系，肝臟免疫學特性與黏膜免疫系統(tǒng)之間存在諸多相似之處，共生菌對肝臟免疫細胞的組成及功能亦有顯著影響。呼吸道內也存在著大量的共生菌，對肺臟局部黏膜免疫應答亦具有重要的調控作用。黏膜及其相關組織亦是腫瘤好發(fā)部位，肺癌、肝癌、腸癌等均是危害人類健康的嚴重問題，共生菌信號對機體抗腫瘤免疫應答的影響是值得深入探討的科學問題。

CCL24是屬于CC趨化因子家族的細胞因子通過CCR3受體相互作用，募集嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、Th2細胞及中性粒細胞等，在過敏性炎癥中起重要作用，并與原發(fā)性結腸直腸癌、肺臟及肝臟轉移瘤等密切相關[4-5]。胰島素樣生長因子1(IGF-1)是一種分子結構類似于胰島素的活性蛋白多肽物質，通過與其特定受體結合，可以調節(jié)機體細胞的生長、發(fā)育、增殖及凋亡等，參與機體組織器官發(fā)育、生長、血糖調節(jié)、細胞分化等生理過程，同時在機體感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展、創(chuàng)傷修復等病理過程亦發(fā)揮重要作用[6-8]。

本研究通過ELISA方法檢測萬古霉素、新霉素、氨芐青霉素及甲硝唑等四種抗菌藥物聯(lián)合飼喂4～6周后的共生菌缺失小鼠及正常小鼠血清、肺臟、肝臟中CCL24及IGF-1的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，共生菌缺失小鼠血清中CCL24的表達水平較正常小鼠血清明顯升高(P<0.01)，IGF-1的表達水平無明顯區(qū)別(P>0.05)；肺臟中CCL24、IGF-1的表達水平均明顯高于正常小鼠(P<0.05)，但肝臟中CCL24、IGF-1的水平卻明顯低于正常小鼠(P<0.05)(圖1，2)。上述結果表明共生菌群可以調控外周血、肺臟、肝臟組織中CCL24及IGF-1的表達水平，該調控作用調控具有組織特異性，本研究結果為進一步探索共生菌與機體相互作用及作用機制提供了新的依據和參考。