李靜怡，徐小艾，晁雨竹，李向東，沈 紅*，張永紅*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動物類國家級實驗教學(xué)示范中心(北京農(nóng)學(xué)院)/北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國科學(xué)院動物研究所，北京 100101)

肌肉是畜禽胴體的重要組成部分，肌纖維是骨骼肌的基本單位。動物骨骼肌纖維數(shù)目在出生前已確定，出生后骨骼肌發(fā)育和肌肉的再生主要依賴于肌衛(wèi)星細(xì)胞[1]。當(dāng)機體受到外界刺激(損傷、鍛煉等)時，處于靜息狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞就會被激活，從肌纖維肌膜與基底膜之間游離出來，經(jīng)歷增殖和定向分化形成完整的新的肌纖維或修復(fù)受損肌纖維[2]。衛(wèi)星細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)到被激活的過程中，受到眾多因子及信號通路的精準(zhǔn)調(diào)控，其中主要調(diào)控因子包括Pax3/7、生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic Regulatory Factors，MRFs)家族等。增殖調(diào)控因子Pax7對肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)中的自我更新、肌肉形成、損傷后修復(fù)等過程中都起重要作用，Pax7在胚胎發(fā)育期的缺乏會導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量大量減少[3]。此外，Pax7作為肌衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)志之一，可通過免疫熒光等方法用于衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定。MRFs家族在肌肉發(fā)育、分化和功能完善的各個環(huán)節(jié)都發(fā)揮調(diào)控作用，包括MyoD、Myf5、myogenin和MRF4[4]。Myf5和MyoD作為肌細(xì)胞增殖期的標(biāo)志，二者的表達代表肌衛(wèi)星細(xì)胞處于活化狀態(tài)[5]。研究骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程對提高動物產(chǎn)肉能力及肉品質(zhì)具有非常重要的意義。

地鱉(EupolyphagasinensisWalker, ESW)作為中國傳統(tǒng)中藥材，具有藥食兼用的特性[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明地鱉具有廣泛的藥理作用，但對于其有效活性成分的深入研究還相當(dāng)薄弱[7]。地鱉富含蛋白質(zhì)，其酶解產(chǎn)物多肽具有一定的抗氧化活性，但研究還較為淺顯，有關(guān)作用機制的研究及對其他動物的作用仍未見報道。本試驗通過體外分離培養(yǎng)雞胸肌衛(wèi)星細(xì)胞，建立H2O2刺激細(xì)胞模型，分析肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及調(diào)控基因的相對表達，初步探討地鱉肽(ESWP)對H2O2刺激下衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響，以期為研究地鱉肽在肌肉發(fā)育中的功能提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、DAPI等購自北京索萊寶科技有限公司，鼠抗雞Pax7單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司，F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司，TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購自北京艾德萊生物科技有限公司，SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRnaseH Plus)(RR420A)購自日本TaKaRa公司，所用引物由華大科技公司合成。熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，全自動酶聯(lián)免疫檢測儀和核酸蛋白測定儀購于美國Merinton公司，熒光PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。1日齡雛雞購自北京富佳種禽中心。

1.2 方法

1.2.1 雞胸肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)分離純化與鑒定 1日齡雛雞心臟采血處死，酒精浸泡后置于超凈臺中，取其胸部肌肉PBS洗滌，剔除血管和脂肪等，用剪刀將其剪至肉糜狀，分別加入Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶消化，然后加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，過細(xì)胞篩后收集離心并重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

采用差速貼壁法去除細(xì)胞懸液中的成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞加入細(xì)胞板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，加入0.1% TritonX-100靜置10 min，10%山羊血清室溫封閉，棄上清，加入一抗Pax7，4℃過夜，加入FITC標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育1 h，加入DAPI染色液，避光孵育5 min，PBS沖洗后，熒光倒置顯微鏡下觀察及拍照。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活情況 SCs細(xì)胞貼壁密度達80%～90%左右，收集細(xì)胞加入含有不同濃度地鱉肽(0、50、100、200、400 μg/mL)，96孔板培養(yǎng)細(xì)胞24 h，然后加入不同濃度H2O2(0、50、100、200、300、400、500 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、16 h。每孔加入MTT 37℃避光培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO后振蕩，置于酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 RT-PCR檢測增殖因子表達水平 試驗分為對照組、H2O2組和地鱉肽組。地鱉肽處理細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，除對照組外，其余各組加入200 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h，然后每孔加入1 mL Trizol試劑，收集細(xì)胞懸液到EP管并加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩后靜置，4℃ 12 000 r/min離心15 min，將上層透明水相層吸到新EP管中，加入0.5 mL異丙醇，靜置后離心棄上清，75%乙醇(DEPC水配制)洗3次，空氣中干燥，加入少量DEPC水，溶解RNA并混勻，核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和OD260/280值。

按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明，制備20 μL反應(yīng)體系，RNA模板3 μL、Oligo(dT)18 1 μL、Rtase 0.8 μL、5×RTRraction Mix 4 μL、Rnase free H2O 補齊20 μL，置于PCR儀內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄，42℃ 50 min、65℃ 15 min、4℃維持，即得cDNA。

建立20 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、上下引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、滅菌蒸餾水5.6 μL，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，49～57℃(引物最適溫度)30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，共40個循環(huán)。采用Step One Software v2.1分析PCR數(shù)據(jù)，按2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。引物根據(jù)GenBank中的序列用Primer5.0軟件設(shè)計，由北京華大科技有限公司合成(表1)。

表1 SYBR real-time PCR 反應(yīng)引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

1.2.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先用Microsoft Excel作初步整理，然后使用Graph pad Prism6.0軟件進行方差分析，差異顯著時進行LSD各組間多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

采用兩步酶消化法分離獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞，差速貼壁法純化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果剛分離的P0代肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)24 h后開始貼壁，為梭形或紡錘形(圖1A)；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h貼壁完全，細(xì)胞數(shù)目不斷增多、相互接觸并聯(lián)結(jié)成網(wǎng)；隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸匯合并有規(guī)律平行排列，直至形成分布均勻的單層細(xì)胞；細(xì)胞傳代培養(yǎng)后形態(tài)飽滿且折光性較強(圖1B)；細(xì)胞凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)上無明顯差異(圖1C)。Pax7是肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息期和增殖期表達標(biāo)志基因，采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色肌衛(wèi)星細(xì)胞檢測基因，結(jié)果陽性細(xì)胞細(xì)胞核表達Pax7，DAPI染核疊加觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7陽性率可達95%以上(圖2)。

圖1 原代肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞形態(tài)(A、B、C分別為P0代、P1代、復(fù)蘇的肌衛(wèi)星細(xì)胞；100×)Fig.1 Cell morphological state during primary SCs culture (ABC mean P0, P1 SCs and recovery SCs.100×)

圖2 肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光染色鑒定(100×)Fig.2 Immunofluorescence staining of muscular satellite cells (100×)

2.2 不同處理條件對肌衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響

采用MTT法檢測不同時間不同濃度H2O2對SCs細(xì)胞活力的影響，結(jié)果隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時刺激細(xì)胞8 h其活力顯著降低為65.16%，此時細(xì)胞受損但并未大量死亡，后續(xù)試驗選取H2O2作用條件為200 μmol/L為受處理細(xì)胞8 h(圖3)。地鱉肽在50～200 μg/mL范圍內(nèi)單獨處理肌衛(wèi)星細(xì)胞，其對細(xì)胞活力影響不明顯，但濃度在400 μg/mL時細(xì)胞活力稍有下降但差異不顯著(圖4A)；當(dāng)?shù)伧M肽濃度在50～200 μg/mL時預(yù)處理細(xì)胞，然后200 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h，此時細(xì)胞活力從77.73%升高至83.89%，與H2O2組相比差異極顯著，且地鱉肽劑量依賴性緩解H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降(圖4B)。

圖3 不同濃度H2O2作用不同時間對肌衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響(與0 μmol/L相比，*P<0.05，** P<0.01)Fig.3 Effects of different concentrations of H2O2 on the viability of SCs cells at different time(Note: Compared with 0 μmol/L, * P<0.05, ** P<0.01)

圖4 地鱉肽對雞衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響(與對照組相比**P<0.01；與H2O2組相比++P<0.01，+P<0.05)Fig.4 Effects of ESWP on the viability of chicken satellite cells viability (Compared with the control group, **P<0.01.Compared with H2O2 group, ++P<0.01, + P<0.05)

2.3 地鱉肽對H2O2刺激后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖因子表達的影響

RT-PCR檢測地鱉肽對H2O2刺激后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖因子表達，結(jié)果與正常組相比，H2O2顯著降低細(xì)胞中Pax7、Myf5和MyoD基因的相對表達量；與H2O2組相比，不同濃度地鱉肽預(yù)處理細(xì)胞可不同程度的促進增殖因子基因表達，其中低濃度地鱉肽顯著增加Pax7和MyoD基因表達量，Myf5基因表達稍有增加，但不具有顯著性差異；中濃度地鱉肽組細(xì)胞內(nèi)基因表達均有顯著提高，高濃度地鱉肽組MyoD基因表達量顯著高于H2O2組(圖5)。

3 討 論

出生后骨骼肌組織中的成肌細(xì)胞是以肌衛(wèi)星細(xì)胞的形式存在，肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌組織的前體細(xì)胞，在骨骼肌的生長、發(fā)育、損傷及移植中具有重要作用。已經(jīng)報道有多種分離純化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法，包括肌組織塊酶消化、直接分離單根肌纖維培養(yǎng)和根據(jù)細(xì)胞表面分子標(biāo)志的流式細(xì)胞和免疫磁珠分選等[8, 9]，本試驗采用酶消化法獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞。肌衛(wèi)星細(xì)胞處于肌膜與基底膜之間，細(xì)胞連接緊密，普通的單種酶處理沒有辦法完全釋放它，所以必須首先將基膜分解[10]。I型膠原酶可消化組織中連接部分使其成為單個細(xì)胞，之后再用胰蛋白酶使肌衛(wèi)星細(xì)胞從肌纖維上充分解離，分離的肌衛(wèi)星細(xì)胞中混有大量成纖維細(xì)胞，通過差速貼壁法對肌衛(wèi)星細(xì)胞進行純化[11, 12]。本試驗采用兩步酶消化法，三次差速貼壁后能獲得陽性率在95%以上的肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)。

注：ABC分別為Pax7、MyoD和Myf5基因；與對照組相比**P<0.01；與H2O2組相比++P<0.01，+P<0.05。Note: A B CmeanPax7; MyoDand Myf5gene respectively; Compared with the control group, **P<0.01. Compared with H2O2 group, ++ P<0.01, + P<0.05.圖5 地鱉肽對H2O2刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of ESWP on the proliferation of chicken satellite cells stimulated by H2O2

肌衛(wèi)星細(xì)胞可以通過特殊的分子標(biāo)記物來鑒定，標(biāo)志性基因有Pax7、M-Cadherin、Desmin、MyoD等[13, 14]。本試驗中選用Pax7單克隆抗體，用間接法對肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息期和增殖期特異表達的標(biāo)志蛋白Pax7進行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，結(jié)果Pax7在胞核染色呈陽性，表明分離培養(yǎng)獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。MRFs家族是啟動和維持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化、發(fā)育和生長的一個主要調(diào)控基因家族，在骨骼肌的生長、發(fā)育、損傷及修復(fù)中具有重要作用，Myf5和MyoD是肌細(xì)胞增殖期的標(biāo)志，只在激活的肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達，能將多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并調(diào)控MyoG促使成肌細(xì)胞融合為肌管[15]。Calor等對小鼠衛(wèi)星細(xì)胞永生化得來的細(xì)胞株C1C12進行病理性缺氧處理，結(jié)果缺氧能顯著抑制MyoD、Myf5和myogenin的表達，阻斷細(xì)胞分化等生命進程[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)H2O2刺激會引起肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)Pax7、MyoD和Myf5基因表達的降低，地鱉肽的添加能緩解這一影響，促進受損細(xì)胞的增殖過程。

本研究通過兩步酶消化法體外分離獲得雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期表達標(biāo)志基因Pax7的陽性細(xì)胞率達95%以上。