楊昕坦，阮 崢，李煥榮

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的腸炎可威脅斷奶仔豬生長，腸炎過程伴隨腸黏膜屏障功能損傷[1]和小腸黏膜免疫系統(tǒng)功能的下降。小腸腸道黏膜屏障可防止致病性物質(zhì)的侵入和阻止腸道內(nèi)細菌及內(nèi)毒素的移位[2]，對保護機體腸道健康具有重要的作用。腸道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，腸黏膜屏障功能的損害可引起通透性增高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。緊密連接在腸壁通透性、阻止內(nèi)毒素和毒性大分子物質(zhì)進入體內(nèi)發(fā)揮著尤為重要的作用[4]。Claudins等4種跨膜蛋白與連接復(fù)合物蛋白、細胞骨架結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成緊密連接復(fù)合物[5]，Claudin-1蛋白(Claudin-1)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)在細胞緊密連接蛋白的表達和合成中發(fā)揮重大作用[6]。

IPEC-J2細胞系(Intestinal porcine epithelial cell line)具有完整的上皮細胞特征，PCV2可感染IPEC-J2并增殖[7]。本研究基于熒光定量PCR方法，通過基因克隆構(gòu)建Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，探索PCV2感染的IPEC緊密連接蛋白的mRNA動態(tài)變化，為PCV2感染損傷腸黏膜屏障的機制提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞及主要試劑

PCV2 SD/2008株：第3代(TCID50為105.25/mL)；豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2.ACC701，DSMZ)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈；TRIzol LS Reagent購自Invitrogen；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA快速膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒等均購自北京博爾優(yōu)公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2感染豬小腸上皮細胞病毒載量的測定 參考文獻方法[8]，將處于對數(shù)生長期的IPEC接種于6孔板中，每孔細胞數(shù)為3×105個，用10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞達60%，感染組以MOI=0.1感染PCV2毒株。分別于感染后4、12、24、48、72 h收集相應(yīng)的小腸上皮細胞。每個時相設(shè)3個重復(fù)。用實驗室建立的PCV2實時熒光定量PCR檢測IPEC中PCV2核酸載量變化。

1.2.2 Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參考文獻方法[9]，由上海生物工程公司合成Claudin-1和ZO-1目的基因的引物。研究所用引物序列和反應(yīng)條件如表1所示。

用Claudin-1和ZO-1特異性引物對IPEC的cDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察，回收純化PCR產(chǎn)物，克隆目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒進行PCR驗證、測序比對及OD值的測定。

表1 Claudin-1、ZO-1、PCV2及看家基因Real-time FQ PCR的引物和PCR條件Tab.1 Real-time FQ-PCR primersand condition of Claudin-1, ZO-1, PCV2 and β-actin

1.2.3 Claudin-1、ZO-1 mRNA熒光定量PCR方法的建立 將Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒10倍系列稀釋為108～103copies/μL，進行SYBR Green I 熒光定量PCR擴增，建立Claudin-1和ZO-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考文獻方法[9]，反應(yīng)條件稍加改動：95℃ 10 min(預(yù)變性)，95℃ 30 s，55℃/51℃，30 s(退火)，72℃ 30 s，40個循環(huán)，50～95℃進行讀板。

1.2.4 PCV2感染的IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA的檢測 收集感染4、12、24、48、72 h的IPEC，每個時相3個重復(fù)。按TRIzol LS Reagent 說明書提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，用建立的熒光定量PCR檢測Claudin-1和ZO-1 mRNA的動態(tài)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

經(jīng)Real-time FQ-PCR反應(yīng)后，獲得每個樣品中Claudin-1、ZO-1基因及看家基因β-actin的拷貝數(shù)。將Claudin-1、ZO-1 cDNA拷貝數(shù)除以同一樣品中看家基因β-actin的cDNA拷貝數(shù)，得到Claudin-1、ZO-1基因與看家基因的一個倍比值，用于表示感染組Claudin-1、ZO-1 mRNA水平的動態(tài)變化。采用獨立樣本t檢驗法，分析感染組與對照組各個時相IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA表達量，并進行差異顯著性分析。P<0.05為差異顯著，在圖中用*表示；P<0.01為差異極顯著，圖中用**表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2感染豬小腸上皮細胞病毒載量的動態(tài)變化

PCV2感染IPEC后，用Real-time FQ PCR檢測5個時相IPEC中PCV2的核酸含量。感染后4 h即可在IPEC中檢測到病毒核酸，48 h時病毒含量達到最高，至72 h時病毒核酸載量曲線呈下降趨勢，表明PCV2可在IPEC中72 h內(nèi)持續(xù)存在，且可增殖(圖1)。

2.2 Claudin-1和ZO-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果分別可見唯一的特異性目的片段，測序結(jié)果經(jīng)比對顯示與參考序列100%相同，OD260/280值為1.97和1.94(1.8～2.0)，表明Claudin-1和ZO-1基因片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。對重組質(zhì)粒進行稀釋并進行熒光定量PCR擴增，擴增曲線顯示，Claudin-1和ZO-1相同濃度梯度質(zhì)粒的擴增曲線基本重合，相鄰濃度梯度質(zhì)粒曲線的間距均勻(圖2A)；溶解曲線(圖2B和2C)顯示，所有產(chǎn)物具單一整齊的峰。兩基因標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均良好(圖2D)，可用于后續(xù)研究。

圖1 PCV2接種后不同時間IPEC中病毒核酸動態(tài)Fig.1 Dynamics of viral nucleic acid in IPEC at different time after inoculated with PCV2

圖2 Claudin-1和ZO-1熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of fluorescence quantitative RT-PCR of Claudin-1 and ZO-1

2.3 Claudin-1和ZO-1 mRNA表達的動態(tài)變化

熒光定量RT-PCR檢測和數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，Claudin-1和ZO-1 mRNA表達變化如圖3。Claudin-1和ZO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在4、12、24、48、72 h這五個時相內(nèi)全部下降，且ZO-1 mRNA表達差異均極顯著，12、48和72 h三個時相Claudin-1 mRNA表達極顯著下降，表明PCV2感染可抑制Claudin-1和ZO-1 mRNA表達。

圖3 PCV2感染后IPEC中claudin-1與ZO-1 mRNA 表達變化Fig.3 Changes of Claudin-1 and ZO-1 mRNA expression in IPEC after infected with PCV2

3 討 論

PCV2可感染IPEC并在其中增殖。病毒的感染可顯著下調(diào)IPEC緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達，提示PCV2感染可以抑制豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達，破壞細胞間的緊密連接，增加腸道通透性。

有報道[5]，PCV2感染IPEC，病毒載量從6 h開始呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，在96 h時達頂峰，之后下降。本研究結(jié)果顯示，病毒載量從4 h上升至48 h達到峰值，之后呈下降趨勢。盡管趨勢有差異，但也說明PCV2可在IPEC中增殖。

腸道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接受損，腸上皮細胞間隙通透性增加，細菌或毒素借此進入體循環(huán)，引起腸道感染[6]?；蛐酒Y(jié)果顯示PCV2感染可引起Claudin等相關(guān)緊密連接蛋白表達的下降，提示PCV2感染可增強小腸腸壁通透性，黏膜組織屏障功能降低，便于毒性大分子和微生物通過，降低了機體的防御能力，為PCV2感染機體提供便利條件[11]。

Claudin對維持和調(diào)節(jié)緊密連接屏障功能有重要作用[12, 13]，Claudin蛋白之間鏈鎖連接形成的細胞旁路途徑是影響緊密連接通透性的主要因素，炎癥性腸病(IBS)就是腸上皮細胞旁路通透性增高[14]。Claudin 24種異構(gòu)體中除Claudin-2、5、6表達增加能降低腸壁屏障功能外，其他Claudin蛋白的缺失能增加腸壁的通透性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)PCV2感染的IPEC表達Claudin1能力降低，提示PCV2可增加腸道上皮的通透性，進而影響腸道黏膜屏障。緊密連接蛋白1(ZO-1)是組成緊密連接的蛋白，廣泛存在于脊椎動物的緊密連接中[16, 17]。大多數(shù)Claudin蛋白通過羧基端與ZO-1、ZO-2、ZO-3的C端連接構(gòu)成連接復(fù)合體，ZO-1從連接復(fù)合體移位會導(dǎo)致腸黏膜緊密連接松弛[18]。肌動蛋白絲將連接復(fù)合體與肌動蛋白環(huán)相連，通過收縮可以調(diào)節(jié)腸壁的通透性[19]。細菌侵襲、細胞因子及炎性介質(zhì)的刺激均可導(dǎo)致Claudin和ZO-1表達的下降，影響緊密連接的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸壁通透性的增加，引起細菌的移位及炎癥反應(yīng)等[9]。腸黏膜受到損傷分泌的TNF-α、INF-γ等炎性細胞因子作用于細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，降低緊密連接蛋白ZO-1的表達，導(dǎo)致緊密連接的瓦解，破壞腸道屏障，增強黏膜通透性[20]。本研究顯示PCV2感染不僅降低Claudin-1表達，同時也降低ZO-1表達，而有報道感染的細胞微絲骨架呈現(xiàn)聚合現(xiàn)象，應(yīng)力纖維減少，細胞界限明顯[7]，可見多重因素同時影響IPEC結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致腸道黏膜損傷。