金 舒，楊敏智，申蘭慧

無錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，無錫214028

保健食品介于一般食品和藥品之間，既有一般食品的功能，又有特定的保健功能，可以用來調(diào)節(jié)身體機(jī)能，提高人們抵御疾病的能力，降低疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]。降壓類化學(xué)藥降壓迅速，療效顯著，因而在一些輔助降壓保健品中非法添加氫氯噻嗪、硝苯地平等降壓藥的行為屢有發(fā)生[2]，其劑型及含量不可控，患者在未知的情況下同時(shí)服用了此類保健品和降壓藥，有極大可能使血壓發(fā)生較大波動(dòng)、甚至驟然下降，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，甚至危及生命。

據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，檢測保健食品中添加降壓類的化學(xué)成分的方法主要有薄層色譜法[3，4]、高效液相色 譜 法[5，6]、液 質(zhì) 聯(lián) 用 法[7，8]、氣 質(zhì) 聯(lián) 用 法[9]。其 中 液 質(zhì)聯(lián)用法成本高昂，不如高效液相色譜法普及，但高效液相色譜法中同時(shí)測定10個(gè)以上成分的方法報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定12種降壓類化學(xué)成分的高效液相色譜方法，該方法采用C18化學(xué)鍵合相常規(guī)柱，耐用性好，分析速度快，操作簡單，可以提高檢測效率。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；XS205電子天平（Mettler Toledo）；XP6電子天平（Mettler Toledo）；Elmasonic S100H通用型超聲波清洗器（德國Elma公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：阿替洛爾（批號100117-201105）、鹽酸可樂定（批號100071-20106）、氫氯噻嗪（批號100309-201404）、卡托普利（批號100318-201103）、鹽酸哌唑嗪（批號100164-201204）、苯磺酸氨氯地平（批號100374-201204）、利血平（批號100041-201213）、硝苯地平（批號100338-201404）、尼群地平（批號100585-201104）、尼索地平（批號100574-200401）、非洛地平（批號100717-201403）、尼莫地平（批號100270-200002），均購自中國食品藥品檢定研究院。

供試品：海洋降壓酶蟻力神牌依欣膠囊（某廠，批號201508060，樣品1）；清脂降壓羅布麻決明子膠囊（某廠，批號20161005，樣品2）；山楂降壓膠囊（某廠，批號20140516，樣品3）；正氣元保壓康TM菊花決明子糖果（批號20160922，陰性樣品）均來自市場抽驗(yàn)樣品。

試劑：乙腈（色譜純，Merck）；甲醇（色譜純，Merck）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純化水（MIlli-Q超純水儀制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A：0.2%的磷酸水溶液，流動(dòng)相B：色譜純乙腈（梯度洗脫：0~9 min，10%B；9~25 min，10%~30%B；25~35 min，30%B）；檢測波長：220 nm；柱溫：35℃；流速：1mL·min-1；進(jìn)樣體積：10μL。

2.2 溶液的制備

對照品儲備液：取上述12種對照品各約10mg，精密稱定，各加甲醇10 mL溶解，分別制成濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。

混合對照品溶液：臨用時(shí)，精密量取各對照品儲備液各1mL，置于同一個(gè)50mL棕色量瓶中，加初始比例流動(dòng)相［乙腈-0.2%磷酸溶液（10∶90）］稀釋至刻度，混勻，制成每毫升各含20μg的混合對照品溶液。

對照品溶液：精密量取各對照品儲備液1 mL，用初始比例流動(dòng)相稀釋制成每毫升各含20μg的單一對照品溶液。

供試品溶液：將供試品均勻研細(xì)，精密稱取0.2 g，置于100 mL棕色量瓶中，加入適量初始比例流動(dòng)相溶解，超聲提取30 min，冷卻至室溫后，用初始比例流動(dòng)相稀釋至刻度，混合均勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

陰性樣品溶液：取不含上述12種降壓類化學(xué)成分的陰性樣品，照上述供試品溶液同法制備陰性樣品溶液。

樣品對照溶液：取不含上述12種降壓類化學(xué)成分的陰性樣品，研細(xì)，取約0.2 g，置100 mL棕色量瓶中，分別加入適量對照品儲備液，按供試品溶液的制備方法制備樣品對照溶液，使各成分的濃度與混合對照品溶液中各成分的濃度相當(dāng)。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法專屬性

取混合對照品溶液、陰性樣品溶液、樣品對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，12個(gè)組分之間完全分離（R＞1.5），峰型良好，樣品對照溶液在與12種對照品色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)一一對應(yīng)的色譜峰，且DAD譜圖與單一對照品溶液的DAD譜圖一致，陰性樣品在對照品相應(yīng)的位置上未出現(xiàn)色譜峰。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取12種對照品各約5 mg，用初始比例流動(dòng)相制成濃度約為100μg·mL-1的混合對照品儲備液。精密量取上述溶液適量，用初始比例流動(dòng)相稀釋成濃 度 為0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.001 mg·mL-1的混合對照溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)樣濃度為自變量，相應(yīng)的峰面積為應(yīng)變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。結(jié)果r均＞0.996 9，表明12種降壓化學(xué)成分在0.001~0.1 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性較好。

2.5 進(jìn)樣精密度

精密量取“2.2”項(xiàng)下的混合對照品儲備液，用初始比例的流動(dòng)相定量稀釋成濃度為0.02 mg·mL-1的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分峰面積的RSD在0.05%~0.94%（n=6），結(jié)果見表1，表明本方法有良好的進(jìn)樣精密度。

2.6 檢測限和定量限

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用初始比例流動(dòng)相逐級稀釋，以3倍信噪比計(jì)算檢測限（LOD），以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備6份樣品對照溶液（按“2.2”項(xiàng)下方法），按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果各樣品中12種化學(xué)成分峰面積的RSD為0.1%～0.8%（n=6）。

表1 各組分回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、進(jìn)樣精密度和檢測限等

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下樣品對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在不同時(shí)間段進(jìn)樣，記錄0、2、4、6、8、12、24 h的色譜圖，按峰面積計(jì)算，12個(gè)組分峰面積的RSD在0.3%~1.1%，結(jié)果表明，各組分在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

取陰性樣品約0.2 g，精密稱定并置于100 mL棕色量瓶中，平行操作9份，按高、中、低質(zhì)量濃度，3份為一組，每份分別加入適量“2.2”項(xiàng)下對照品儲備液適量，制備供試品溶液，按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算，平均回收率為94.1%～103.1%，RSD為0.89%～1.7%（n=9）。

取樣品1約0.2 g，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，分別加入氫氯噻嗪對照品儲備液（相當(dāng)于樣品中氫氯噻嗪的80%、100%、120%）各3份，再按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入其余11種“2.2”項(xiàng)下儲備液適量，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算，平均回收率為94.8%～102.5%，RSD為0.86%～1.6%（n=9）。

取樣品2約0.2 g，精密稱定，置于100 mL棕色量瓶中，分別加入氫氯噻嗪和硝苯地平對照品儲備液（相當(dāng)于樣品中相應(yīng)成分的80%、100%、120%）各3份，再按高、中、低質(zhì)量濃度分別加入其余10種“2.2”項(xiàng)下儲備液適量，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算，平均回收率為95.2%～101.7%，RSD為0.91%～1.8%（n=9）。

樣品3同法操作，平均回收率為95.3%～100.9%，RSD為0.88%～1.7%（n=9）。

2.10 樣品測定

分別取樣品1、樣品2、樣品3各3份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。提取供試品色譜圖中與對照品保留時(shí)間一致的色譜峰的紫外光譜圖，與相應(yīng)的對照品的紫外光譜圖均一致。

表2 樣品測定（n=3）

3 討 論

3.1 柱溫的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了柱溫對色譜峰的影響，結(jié)果顯示，隨著柱溫的升高，色譜峰的保留時(shí)間顯著降低，分離度略有改善。由于在30℃下基線波動(dòng)較大，而溫度過高容易對色譜柱造成損傷，以阿替洛爾為例考察柱效，結(jié)果顯示，在35℃時(shí)各成分分離效果佳，故本實(shí)驗(yàn)柱溫選在35℃。

3.2 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同鍵合相色譜柱Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Waters XBridge-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Waters XSelect CSH C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）的分離效果。結(jié)果顯示，Agilent Extend-C18色譜柱能使待測的12種組分均有適宜的保留，峰型均較好，且各組分的分離效果較佳。

3.3 波長的選擇

國家食品藥品監(jiān)督管理局“藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批件號：2009032）”[10]中阿替洛爾、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定、卡托普利、哌唑嗪、利血平的檢測波長為220nm；六氫吡啶類降壓成分氨氯地平、硝苯地平、尼群地平、尼索地平、非洛地平、尼莫地平檢測波長為235 nm。本實(shí)驗(yàn)考察了220 nm和235 nm波長下各組分的色譜行為，結(jié)果表明，235 nm波長下卡托普利幾乎無響應(yīng)；但是220 nm波長下12個(gè)組分均有較高的響應(yīng)，且各組分在該波長處的測定結(jié)果與在各自最大吸收波長處的測定結(jié)果一致。最終選擇220nm為12個(gè)組分的檢測波長。