陳莉梅，楊亞楠，陶春蕾

安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，合肥230012

依非韋倫（Efavirenz）是一種非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI），常與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)用，用于治療兒童和成人的艾滋病病毒1型（HIV-1）感染[1]。依非韋倫片主要用于艾滋病患者的抗病毒治療，為國家保障藥物之一。我國目前由Merck Sharp&Dohme（Australia）Pty.Ltd.進(jìn)口該品種的片劑和膠囊劑，于2016年實(shí)現(xiàn)進(jìn)口藥品國產(chǎn)化。依非韋倫片作為一線抗HIV病毒藥物，臨床需求量大。

國內(nèi)外依非韋倫血藥濃度的檢測方法主要為高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS），但尚未有全面的方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容供參考，且方法學(xué)驗(yàn)證中關(guān)于溶血及高脂樣品的配制未有詳盡描述。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS），作蛋白質(zhì)沉淀的血樣處理，以2015版《中國藥典》為指導(dǎo)，進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，為依非韋倫臨床藥代動力學(xué)研究與方法學(xué)驗(yàn)證提供檢測方法及參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters UPLC-API 4000三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API4000質(zhì)譜儀（美國AB公司）；百萬分之一電子天平（XP6，梅特勒－托利多儀器有限公司）；離心機(jī)（G-16C，德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

依非韋倫標(biāo)準(zhǔn)品（USP，純度99.7%，批號R038U0）；內(nèi)標(biāo)：依非韋倫-D5［TLC PharmaChem.Inc，純 度96.2%（HPLC）/98.5%（Isotopic Enrichment），批號：1866-041A6，加拿大TLC制藥公司］；乙腈（色譜純，Sigma）；甲醇（色譜純，Sigma）；乙酸銨（分析純，aladdin）。

新鮮血漿由本校附屬醫(yī)院提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（2mm×100mm，5μm，110A）；流動相：乙腈-10mmol·L-1乙酸銨（80∶20），等度洗脫；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40℃；樣品盤溫度：4℃；進(jìn)樣量：2μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源；負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）測定藥物濃度；離子噴霧電壓為-4200 V，離子源溫度為550℃；依非韋倫及依非韋倫-D5去簇電壓均為-90 eV，入口電壓均為-10 eV，碰撞池出口電壓均為-15eV，碰撞電壓分別為-25eV和-24 eV；用于定量的離子對分別為m/z 314.2→243.9，m/z319.0→247.9。

1.4 血漿樣品處理方法

精密量取血漿樣品50μL于2.0 mL 96孔板中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液（2μg·mL-1）50μL，然后加入乙腈200μL，于4℃、4200r·min-1離心10 min。取上清液50μL至干凈2.0 mL 96孔板中，然后加入乙腈200μL，渦旋混勻1 min，于4℃、4200 r·min-1離心10 min，待進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2μL。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 質(zhì)譜分析 將依非韋倫、依非韋倫-D5儲備液用甲醇稀釋至1μg·mL-1，采用蠕動泵模式進(jìn)樣，按“1.3.2”項(xiàng)操作，進(jìn)行碎片離子分析。圖1為相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖。

圖1 依非韋倫（A）、依非韋倫-D5（B）的[M-H]-的二級全掃描質(zhì)譜圖

2.1.2 專屬性考察 當(dāng)使用色譜方法測定待測物時，為區(qū)分生物基質(zhì)中干擾的能力，分別取6名受試者的空白血漿各50μL，按“1.4”項(xiàng)下方法操作（不加內(nèi)標(biāo)）進(jìn)樣2μL，得色譜圖2中A、B；將LLOQ（定量下限濃度）水平的依非韋倫和內(nèi)標(biāo)依非韋倫-D5溶液加入空白血漿中，同法操作，得色譜圖2中C、D；代表性受試者用藥后，同法操作，得色譜圖2中E、F。依非韋倫和依非韋倫-D5的保留時間均在1.75 min左右，且空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾依非韋倫和內(nèi)標(biāo)依非韋倫-D5的測定。

2.1.3 交叉干擾 為了評估待測物與內(nèi)標(biāo)物之間是否存在交叉干擾，分別考察了待測物對內(nèi)標(biāo)物的干擾及內(nèi)標(biāo)物對待測物的干擾，與同一分析批中LLOQ樣品的內(nèi)標(biāo)物或待測物峰面積比較。結(jié)果顯示，待測物對內(nèi)標(biāo)物干擾為0.0%，內(nèi)標(biāo)物對待測物干擾不大于1.0%，說明兩者之間不存在交叉干擾。此項(xiàng)為選擇性考察。

圖2 血漿中依非韋倫及依非韋倫-D5的色譜圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品每天新鮮配制。使用空白基質(zhì)配制7個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（每個濃度水平2個重復(fù)）。血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為：0.1、0.2、0.5、1、4、7、8μg·mL-1。分別以待測物依非韋倫濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，待測物依非韋倫色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)物依非韋倫-D5色譜峰面積（Ai）的比值（Y=As/Ai）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的直線方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。驗(yàn)證中某批次標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.494x+8.32×10-6（r=0.999 1），線性范圍為0.1～8μg·mL-1，最低定量濃度為0.1μg·mL-1，r>0.99，表明線性關(guān)系良好。

2.1.5 定量下限及精密度與準(zhǔn)確度 血漿中質(zhì)量控制（QC）樣品的質(zhì)量濃度為：0.1μg·mL-1（定量下限濃度，LLOQ）、0.3μg·mL-1（低濃度，LQC）、2μg·mL-1（中濃度，MQC）、6μg·mL-1（高濃度，HQC），以依非韋倫LLOQ、LQC、MQC和HQC四個濃度的質(zhì)控樣品考察批內(nèi)及批間精密度與準(zhǔn)確度，每一濃度平行制備6個樣品。根據(jù)“1.4”項(xiàng)下方法分別處理3批。考察了定量下限，低、中、高濃度水平（LLOQ、LQC、MQC、HQC）下的批內(nèi)及批間精密度（見表1），表明方法準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性良好。

2.1.6 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 考察內(nèi)標(biāo)工作液濃度（2μg·mL-1）下和待測物低、中、高濃度（0.3、2、6μg·mL-1）下血漿樣品的提取回收率，及待測物低、中、高濃度下血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)。按“1.4”項(xiàng)下方法處理低、中、高濃度的血漿樣品，得到提取基質(zhì)待測物峰面積NEFV及內(nèi)標(biāo)物峰面積NIS。將待測物工作液及內(nèi)標(biāo)工作液混合，分別配制成0.050/0.333μg·mL-1（待測物/內(nèi)標(biāo)）、0.333/0.333μg·mL-1（待測物/內(nèi)標(biāo)）、1.000/0.333μg·mL-1（待測物/內(nèi)標(biāo)）濃度的中間溶液；將6種不同空白基質(zhì)經(jīng)“1.4”項(xiàng)下方法處理得到上清液；取中間溶液50μL，上清液50μL，乙腈150μL，混勻進(jìn)樣得到未提取待測物峰面積AEFV及內(nèi)標(biāo)物峰面積AIS。取上述中間溶液50μL，加入乙腈200μL得到純?nèi)芤簶悠?，進(jìn)樣得到待測物峰面積均值PEFV及內(nèi)標(biāo)物峰面積均值PIS。按下式計(jì)算：

結(jié)果見表2，提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)的RSD均＜15%。

表1 依非韋倫的精密度與準(zhǔn)確度

表2 依非韋倫提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

2.1.7 溶血及高脂效應(yīng) 溶血及高脂效應(yīng)屬于基質(zhì)效應(yīng)的一種，可能影響分析物的定量。本試驗(yàn)使用模擬的溶血血漿樣品（加入2%的溶血全血至未溶血的血漿中，視為嚴(yán)重溶血）及高脂血漿樣品（在正常空白血漿內(nèi)加入脂肪乳注射液，至少3mg·mL-1，以甘油三酯含量計(jì)算）配制成濃度為0.3、6μg·mL-1的血漿樣品進(jìn)行評估。結(jié)果得溶血及高脂效應(yīng)的低、高濃度相對偏差在±15.0%范圍內(nèi)，即溶血及高脂基質(zhì)效應(yīng)不影響分析物定量。

2.1.8 稀釋可靠性 在分析過程中，如果待測物濃度高于定量上限，則需要對血漿樣品進(jìn)行稀釋。為了驗(yàn)證稀釋質(zhì)控樣品被稀釋后此樣品仍在測定線性范圍內(nèi)、且濃度值可接受，用空白血漿配制高于高濃度的稀釋質(zhì)控樣品（30μg·mL-1）。再用空白健康人血漿5倍稀釋該樣品，平行稀釋6份，稀釋后血藥濃度為6μg·mL-1。稀釋后樣品隨新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品一同測定。測定的濃度乘以稀釋倍數(shù)得到相應(yīng)的稀釋前濃度。進(jìn)樣后各濃度準(zhǔn)確度偏差均在±15.0%范圍內(nèi)，且精密度（RSD）為2.2%。

2.1.9 儲備液及工作液穩(wěn)定性 將依非韋倫標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中，配制成1 mg·mL-1的儲備液，將依非韋倫儲備液用50%甲醇水溶液分別稀釋成160μg·mL-1和2μg·mL-1工作液，考察依非韋倫儲備液及工作液在室溫放置和0℃～8℃冰箱放置的穩(wěn)定性，與新鮮配制的依非韋倫儲備液及工作液比較。本試驗(yàn)測得儲備液室溫放置23h、0℃～8℃放置43d的平均穩(wěn)定性分別為99.9%、99.6%；工作液室溫放置27 h、0℃～8℃放置43 d的平均穩(wěn)定性分別為100.4%（ULOQ）、100.5%（LLOQ）和100.4%（ULOQ）、100.3%（LLOQ）。以上結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品每個濃度的平均值的準(zhǔn)確度均在100.0%±15.0%范圍內(nèi)，且每個濃度的精密度應(yīng)均＜15.0%，證明了在考察時間內(nèi)儲備液及工作液的穩(wěn)定性良好。

2.1.10 血漿樣品穩(wěn)定性 取配制后的低濃度（0.3μg·mL-1）、高濃度（6μg·mL-1）血漿樣品50μL，按“1.4”項(xiàng)下方法處理，隨新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線一同測定，每個濃度水平平行測定6份。結(jié)果顯示各濃度準(zhǔn)確度偏差均在±15.0%范圍內(nèi)，且精密度RSD均＜15%。驗(yàn)證了室溫放置24 h穩(wěn)定性、處理后室溫放置20 h穩(wěn)定性、處理后0℃～8℃放置99 h穩(wěn)定性，5次反復(fù)凍融（-20℃和-70℃）、長期冷凍穩(wěn)定性（72 d）及處理后樣品再進(jìn)樣穩(wěn)定性（96h）、全血穩(wěn)定性（室溫及冰浴條件下各放置2h，與放置0 h樣品比較兩者差異的%）等。表明本試驗(yàn)所開發(fā)的方法可以保證不同情況下生物樣品的穩(wěn)定性。

2.1.11 最大進(jìn)樣針數(shù) 為評估分析批最大進(jìn)樣針數(shù)及方法的耐用性，經(jīng)驗(yàn)證分析批最大進(jìn)樣針數(shù)為197針，即在生物樣品分析中各分析批內(nèi)進(jìn)樣針數(shù)不得超過197針。

2.2 方法學(xué)應(yīng)用

經(jīng)上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會審核批準(zhǔn)，本試驗(yàn)招募36名健康受試者（男女比例適當(dāng)），受試者對本試驗(yàn)知情同意并簽署知情同意書。受試者隨機(jī)分成A、B兩組，每組各18名。實(shí)驗(yàn)為：第一周期18例受試者空腹口服試驗(yàn)制劑（A藥）600mg，240 mL溫水送服；另外18例受試者空腹口服參比制劑（R藥，STOCRIN?）600mg，240 mL溫水送服；35 d后交叉給藥。

根據(jù)原研說明書和調(diào)研文獻(xiàn)[2，3]表明，依非韋倫的健康成人的平均消除半衰期為52~76 h，根據(jù)《中國藥典》2015版附錄中“化學(xué)藥物人體相對生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則”及2016年國家食品藥品監(jiān)督管理總局下發(fā)的《關(guān)于發(fā)布普通口服固體制劑參比制劑選擇和確定等3個技術(shù)指導(dǎo)原則的通告（2016年第61號）》之附件3“以藥動學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評價指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則”等的相關(guān)要求及規(guī)定，建議藥物人體生物等效性試驗(yàn)中清洗期一般不應(yīng)短于7個消除半衰期。參照本品藥動學(xué)特征，依非韋倫的健康成人的平均消除半衰期為52~76 h，為了避免上個周期內(nèi)的處理影響到隨后一周期的處理，因此確定本次生物等效性試驗(yàn)清洗期為35d，即清洗時間約為840 h，大于7個清除半衰期，完全符合相關(guān)要求。采血點(diǎn)為給藥前及給藥后0.5、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0h，共計(jì)24個采血時間點(diǎn)。

如圖3所示，為35名受試者（018號受試者第二周期采血脫落，予以剔除，故不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析）口服依非韋倫試驗(yàn)制劑與參比制劑600 mg后的平均血藥濃度-時間曲線。結(jié)果表明，本方法測定依非韋倫可用于健康受試者的藥代動力學(xué)研究。

圖3 平均藥-時曲線（x±s，n=35）

采用WinNonlin 7.0軟件計(jì)算得到依非韋倫人體藥動學(xué)參數(shù)（見表3），結(jié)果顯示，空腹試驗(yàn)條件下試驗(yàn)制劑和參比制劑的吸收速度（Cmax和Tmax）和吸收程度（AUC0-72h）相當(dāng)?？崭菇o藥條件下Cmax、AUC0-72h的幾何均數(shù)比值（試驗(yàn)制劑/參比制劑）的90%置信區(qū)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果均在可接受的80.00%~125.00%等效范圍內(nèi)，分別為96.60%~111.31%、100.76%~109.80%。并經(jīng)雙單側(cè)t-檢驗(yàn)分析后，P值均＜0.05，即兩制劑在本試驗(yàn)空腹給藥條件下具有生物等效性。

表3 依非韋倫主要藥動學(xué)參數(shù)（x±s）

3 討 論

3.1 液相色譜條件及血漿樣品處理方法

依非韋倫Log P=4.6，幾乎不溶于水，故流動相選擇大比例的有機(jī)相。文獻(xiàn)[4，5]有使用（甲醇+0.3%甲酸）-（水+0.3%甲酸）（80∶20）及0.1%甲酸水溶液-甲醇（20∶80）作為流動相的，嘗試后發(fā)現(xiàn)峰形較差，故嘗試用乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨（85∶15）作為流動相，發(fā)現(xiàn)峰形較好，隨后在10 mmol·L-1乙酸銨中分別添加0.1%甲酸及0.1%氨水，發(fā)現(xiàn)待測物響應(yīng)減小，故最終選擇乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨（80∶20）作為流動相。文獻(xiàn)[6，7]有使用蛋白沉淀及液液萃取方法處理樣品的，嘗試蛋白沉淀法，發(fā)現(xiàn)回收率與基質(zhì)效應(yīng)等均能滿足檢測要求，且樣品處理簡便快速。因依非韋倫Cmax較大，定量下限較高，此方法的開發(fā)耗時較短。該方法操作簡便、樣品檢測時間短，能達(dá)到準(zhǔn)確定量及分析的目的。

3.2 采血點(diǎn)設(shè)計(jì)及受試者例數(shù)選擇

由于依非韋倫分布和消除在個體內(nèi)的變異較小且是一個長半衰期的藥物，所以采用截取AUC來描述藥物吸收的總暴露量，即用AUC0-72h來代替AUC0-t，同時結(jié)合WHO《Notes on the design of bioequivalence study：Efavirenz》建議采血周期為72 h，經(jīng)綜合考慮，最終確定采血周期為72 h。參考該品種相關(guān)WHO有關(guān)人體生物等效性試驗(yàn)記載，該品種人體生物等效研究的樣本量在30~48例，依非韋倫片的變異系數(shù)20%~25%。通過統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算受試者例數(shù)為19~28例，同時考慮脫落率問題，最終確定受試者人數(shù)為36例。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證的完整性

文獻(xiàn)[4，6，8]中關(guān)于儲備液及工作液的穩(wěn)定性考察及溶血與高脂效應(yīng)的具體操作未見詳盡描述。本試驗(yàn)對于溶血和高脂樣品的配制進(jìn)行了描述并進(jìn)行驗(yàn)證，還考察了不同貯備條件下待測物及內(nèi)標(biāo)溶液的穩(wěn)定性。針對全血穩(wěn)定性，大多數(shù)文獻(xiàn)未對其進(jìn)行考察，考慮到臨床采血過程，本試驗(yàn)考察了室溫及冰浴條件下放置2 h的全血樣品的穩(wěn)定性。試驗(yàn)包含了較完整的方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容，涵蓋整個臨床采血、樣品運(yùn)輸及樣本檢測所可能出現(xiàn)的情況，試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法能夠準(zhǔn)確定量人血漿中依非韋倫的濃度。