郭洪梅，趙 丹，曹 琳，夏 輝

徐州市第一人民醫(yī)院 藥學部，徐州221000

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。近50年來許多國家報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占惡性腫瘤的第二位，死亡率占第二位[2，3]。當前肺癌的治療主要是化學療法和分子靶向治療?；熤饕靡恍┢茐腄NA結構和功能的藥物，如順鉑、奧沙利鉑[4]；影響微管合成的藥物長春堿、紫杉醇等[5]。近年來興起的小分子靶向藥物如表皮生長因子（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKs）[6]等。盡管如此，這些藥物的療效十分有限，臨床上對于病人生存期及生活質量改善并不盡如人意，肺癌的治療現(xiàn)狀仍然堪憂。相比而言，中醫(yī)藥由于其成分復雜，往往具有多靶點、多重功效且副作用小的特征而越來越被人們重視[7]。目前已有多種中草藥被作為主要或輔助藥物用于肺癌的治療[8]。

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）的干燥全草，又名蛇舌草、蛇利草、蛇總管、二葉葎等[9]。白花蛇舌草主要分布于浙江、江西、福建、湖北、廣東及西南等地，具有清熱解毒、活血化瘀、利濕通淋等作用，常用于治療腫瘤、黃疸型肝炎、胃腸炎、肺炎等疾病[10]。白花蛇舌草具有明顯的抗腫瘤活性，臨床上經(jīng)常用于治療各種癌癥，如胃癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌等消化道、生殖系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的癌癥[11]。

目前，對于白花蛇舌草抗腫瘤物質基礎及作用機制的研究已取得了一些成績，但是白花蛇舌草抗肺癌的療效和分子機制尚不明確，嚴重制約著白花蛇舌草的臨床應用[12]。因此有必要對白花蛇舌草抑制肺癌的作用機制進行深入、系統(tǒng)的研究，為白花蛇舌草開發(fā)成肺癌治療藥物提供理論基礎。本研究通過體內(nèi)體外研究深入探討了白花蛇舌草（BHSSC）水提物的抗腫瘤療效及其機制，發(fā)現(xiàn)了其促進腫瘤細胞凋亡的關鍵信號通路，將為闡明白花蛇舌草的抗肺癌機理提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人肺癌細胞株A549和PC-9細胞，購于上海中科院細胞庫；7-氨基放線菌素D（7-AAD，美國BD公司）。

1.2 動物

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：201810896。

1.3 藥品與試劑

肺癌治療陽性藥順鉑（CDDP，美國MCE公司，No：HY-17394），溶于二甲亞砜（DMSO）中制成濃度為20 mmol·L-1的儲備液，貯存于-20℃冰箱，稀釋后用于實驗；MTT（美國Sigma公司）；RMPI-1640培養(yǎng)基粉末、DMEM培養(yǎng)基粉末、胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）、胎牛血清、青霉素加鏈霉素（美國Gibco公司）；PE Annexin V凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公 司，Lot：7026588）；Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38抗體（美國CST公司）；EDTA（乙二胺四乙酸，國藥集團）。

2 實驗方法

2.1 白花蛇舌草（BHSSC）水提物的制備

白花蛇舌草30 g加入10倍量沸水提取3次，每次1 h，提取液經(jīng)紗布過濾后混合，旋轉蒸發(fā)濃縮至100 mL，0.22μmol·L-1過濾除菌后置于4℃保存，用于后續(xù)實驗研究。用藥劑量按實驗動物與成人體表面積比等效量核算比率，計算動物的等效劑量。實驗時以去離子水配制成所需濃度，放4℃冰箱保存。

2.2 MTT法檢測BHSSC水提物對肺癌細胞的增殖活力的影響

MTT法用于檢測不同候選藥物對2種肺癌細胞株A549、PC-9細胞的增殖抑制作用。取對數(shù)生長期的細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中。BHSSC水提物按照預設的藥物濃度加藥（0、50、100、200、300、400、500、600μg·mL-1），各組設置3個復孔，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。200μg·mL-1BHSSC水提物處理A549、PC-9細胞不同時間（0、6、12、24、48、72和96h），藥物處理時間結束后，每孔加入濃度為5g·L-1的MTT 10μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入DMSO 100μL于振蕩器上溶解10 min，測定A570nm/A630nm值并計算增殖抑制率。 增殖抑制率 （%）=（Atest570nm-Atest630nm）/（AControl570nm-AControl630nm）×100%。

2.3 流式細胞術檢測BHSSC水提物誘導肺癌細胞凋亡

取對數(shù)生長期的肺癌細胞株A549、PC-9細胞，以1×105個/mL的密度種入6孔板后于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細胞長到80%融合度后分別加入不同濃度的BHSSC水提物（0、200、400μg·mL-1）處理48 h。到達時間點后用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌細胞2次（2 000 r·min-1離心5 min），收集1×105個細胞；加入結合緩沖液懸浮細胞100μL；加入Annexin V-PE（PE標記的膜磷脂結合蛋白V，美國BD公司）5μL混勻后，加入7-AAD 5μL，混勻。室溫、避光、反應15 min后，用流式細胞儀檢測（GUAVA Easy Cyte，Millipore，US）肺癌細胞凋亡效果。

2.4 Western blot法檢測BHSSC水提物對肺癌細胞中MAPK信號通路的影響

取對數(shù)生長期的肺癌細胞株A549和PC-9細胞，以2×105個/mL的密度種入6孔板后于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞長到80%融合度后分別加入不同濃度的BHSSC水提物（0、100、200、400μg·mL-1）處理48 h，并以20μmol CDDP作為陽性對照。在冰上用裂解緩沖液RIPA裂解細胞30 min，提取全蛋白，加入上樣緩沖液，用煮樣器煮沸3min后，上樣用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再以100V轉膜1h，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵育一抗（1∶1000稀釋）于4℃孵育過夜，用TBST（含0.1%吐溫-20）漂洗4遍（間隔10 min）后，二抗（1∶10 000稀釋）孵育1 h，經(jīng)TBST漂洗4遍后于ECL曝光顯影，曝光Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38等目的條帶，用Image J軟件對曝光的條帶的相對灰度值進行計算并統(tǒng)計。

2.5 裸鼠移植瘤模型檢測BHSSC水提物對體內(nèi)肺癌生長的抑制活性

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，3~4周齡，體重（14±2）g，適應飼養(yǎng)一周后，根據(jù)體重平均分為模型組、BHSSC給藥組（10 mg·kg-1）和陽性藥順鉑組（1 mg·kg-1）三個組，每組7只動物；取生長良好的A549細胞使用預冷PBS洗滌后消化，再用預冷PBS洗滌兩次后計數(shù)，調整細胞濃度與基質膠1∶1混合成濃度為2×107/mL的細胞懸液，放置于冰上備用；采用皮下注射方法，以0.2 mL/只的量接種于裸鼠右前肢腋下；造模3天后，腹腔注射給藥，每兩天記錄裸鼠體重、瘤體積（瘤體積按V=0.5×a×b2公式計算，其中a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）；給藥21天后處死小鼠，終止實驗。

3 結 果

3.1 MTT法檢測BHSSC水提物對肺癌細胞增殖的影響

為了驗證候選BHSSC對肺癌細胞增殖的影響，本實驗采用MTT法檢測不同BHSSC水提物對肺癌細胞A549、PC-9的增殖抑制作用。作用48 h后，結果如圖1A所示，BHSSC水提物對肺癌細胞有顯著的劑量依賴的增殖抑制作用，當濃度達到600 μg·mL-1時抑制率超過95%，對A549細胞的IC50為287μg·mL-1，PC-9細胞的IC50為326μg·mL-1。并且隨著作用時間的延長，BHSSC水提物的作用越顯著（圖1B）。給藥濃度達到400μg·mL-1時，A549細胞和PC-9細胞發(fā)生明顯皺縮變圓（圖1C）。

圖1 白花蛇舌草對肺癌細胞株A549和PC-9細胞的增殖抑制活性。

3.2 流式細胞術檢測BHSSC水提物對肺癌細胞凋亡的影響

本實驗通過流式細胞術檢測BHSSC水提物誘導肺癌細胞凋亡活性。如圖2所示，不同濃度BHSSC水提物處理A549細胞和PC-9細胞48 h后，PE+/7-AAD細胞增多，即細胞開始發(fā)生凋亡。綜合分析發(fā)現(xiàn)，BHSSC水提物能劑量依賴性促進兩種肺癌細胞的凋亡。

3.3 荷瘤裸鼠模型檢測BHSSC水提物體內(nèi)抗肺癌活性

如圖3所示，通過荷瘤裸鼠實驗，發(fā)現(xiàn)BHSSC水提物有顯著的延緩腫瘤生長活性，與模型對照組相比，差異顯著（P<0.01）。并且BHSSC水提物對小鼠體重幾乎沒有影響（P>0.05），提示其毒副作用較弱。

3.4 BHSSC水提物對MAPK通路的影響

如圖4所示，BHSSC水提物能夠顯著降低A549細胞MAPK通路中關鍵蛋白Erk、p38、Junk的表達和磷酸化水平，從而抑制MAPK通路的活化，最終誘導肺癌細胞凋亡，并且400μg·mL-1的凋亡誘導效果與20μmol CDDP的效果相當。

4 討 論

中藥抗腫瘤以其具有多靶點、多重功效顯著、毒副作用小等特點日益受到國內(nèi)外學者的重視。白花蛇舌草是我國傳統(tǒng)中藥，是臨床治療腫瘤的有效藥物。近年來開展了大量的臨床和基礎研究工作來揭示其抗腫瘤機制和物質基礎。但是白花蛇舌草對肺癌的治療效果尚缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)支撐，且其對肺癌的抗腫瘤活性目前也大多處于實驗研究階段，抑制肺癌的分子機制尚未明確。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）鏈是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡中的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞質功能活動中發(fā)揮關鍵作用[13]。MAPK有4個主要亞族：ERK、JNK、p38MAPK和ERK5。MAPK可促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新血管生成[14]。新血管生成后可為腫瘤提供更多的營養(yǎng)，加速腫瘤的生長，促進癌細胞的擴散。MAPK通路的異?；罨c腫瘤的增殖、轉移和侵襲密切相關。因此MAPK通路可作為抗腫瘤靶點而被廣泛研究。本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草水提物對兩種肺癌細胞有一定的殺傷作用。當藥物達到一定濃度時，BHSSC水提物對肺癌細胞有顯著的劑量依賴的增殖抑制作用。當濃度達到600μg·mL-1時抑制率超過95%，對A549細胞的IC50為287μg·mL-1，PC-9細胞的IC50為326μg·mL-1；并且隨著作用時間的延長，BHSSC水提物的抑制作用越顯著。通過荷瘤小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，BHSSC水提物也具有顯著的體內(nèi)抗肺癌活性，給藥22天后，腫瘤生長抑制率達到65%。此外連續(xù)給藥對動物體重無顯著影響，提示BHSSC水提物的毒副作用較弱。進一步探索發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草水提物能顯著抑制MAPK通路中關鍵分子ERK、jnk、p38的磷酸化表達，從而促進肺癌細胞凋亡及抑制腫瘤的生長和侵襲。

本研究可為闡明白花蛇舌草抑制肺癌的分子機理提供理論參考，并且為白花蛇舌草研發(fā)成具有中醫(yī)藥特色的肺癌治療藥物提供依據(jù)。

圖2 白花蛇舌草處理后引起肺癌細胞株A549和PC-9細胞凋亡

圖3 白花蛇舌草體內(nèi)抗腫瘤活性

圖4 白花蛇舌草對細胞凋亡相關MAPK通路關鍵蛋白表達及磷酸化的影響