何立超 楊海燕 孫秀秀 吳文敏 馬素敏 靳國鋒,?

(1武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430205；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

輻照是一種有效的物理殺菌方式,可以殺滅食品中的大部分微生物。目前,國際上已有20 多個國家批準(zhǔn)了輻照技術(shù)在部分生肉或熟肉制品中使用。我國也于1997年6月正式頒布六大類七大項輻照食品國家標(biāo)準(zhǔn),批準(zhǔn)允許輻照技術(shù)在熟畜禽肉制品中使用[1],但由于輻照會使食品體系中產(chǎn)生大量活性自由基,導(dǎo)致食品成分發(fā)生氧化分解,進而影響其色、香、味[2-6],極大地制約了其在肉制品中的推廣應(yīng)用。目前,輻照技術(shù)已廣泛應(yīng)用于泡椒鳳爪產(chǎn)品的殺菌保鮮[7-9],但在其他的生、熟肉制品中的應(yīng)用尚未普及。

研究表明,輻照會使肉品產(chǎn)生臭雞蛋味、甜味、血腥味、烤玉米味、燒焦味、硫磺味及金屬味等令人不愉快的異味[10-12],這些異味主要來自肉品中的含硫氨基酸的氧化分解,起主要貢獻作用的是一些含硫的揮發(fā)性化合物,如二甲基二硫化物、甲基硫醇、二甲基硫醚、乙酸甲硫醇酯等[12-14]。對于肉品,輻照誘導(dǎo)的肌肉蛋白質(zhì)、脂肪氧化都與其輻照異味的形成顯著正相關(guān)[15]。前期研究表明,火腿腸經(jīng)過不同劑量60Co-γ 射線輻照后,高劑量輻照組的蛋白質(zhì)、脂肪氧化程度較低劑量輻照組高,且輻照異味強度也顯著高于低劑量組,說明肉制品輻照異味的形成主要與自由基誘導(dǎo)氧化有關(guān)[16]。喬宇等[17]研究了竹葉黃酮抗氧化劑對泡椒鴨掌輻照異味的控制效果,發(fā)現(xiàn)竹葉黃酮可以有效去除鴨掌的異味,并提高其貯藏過程中的品質(zhì)。本研究選取維生素(VE)、茶多酚、迷迭香提取物3 種抗氧化劑,在火腿腸加工過程中添加到肉糜中,探討其對火腿腸輻照異味形成的影響,并篩選出對火腿腸輻照異味控制效果最佳的一種抗氧化劑,然后再進行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗,以期為熟肉類制品輻照異味的控制提供數(shù)據(jù)支撐,進一步推動輻照技術(shù)在肉制品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬后腿肉及調(diào)味料購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中百超市。鹽酸胍、2,4-二硝基苯腈、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)等分析純試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。VE(純度96%)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；迷迭香提取物粉末(純度99%),購自山東西唐生物科技有限公司；茶多酚粉末(TP≥90),購自無錫明欣生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

60Co-γ 輻照源(活度1.1×1016Bq),湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照實驗中心；BJRJ-22T 絞肉機、BZBJ-40 斬拌機,杭州艾博科技工程有限公司；SCR20BC 型高速冷凍離心機,德國Sigma 公司；T18 basic 型高速勻漿機,德國IKA 公司；2000C 型紫外-可見分光光度計,美國Thermo 公司。

1.3 火腿腸制作工藝

火腿腸配料：肉總量按100%計(豬瘦肉∶肥膘=4 ∶1),玉米淀粉5%、白砂糖1.5%、食鹽2%、復(fù)合磷酸鹽0.3%、亞硝酸鈉0.01%、調(diào)味料0.6%。

工藝流程：原料肉預(yù)處理→斬拌(添加抗氧化劑)→配料→灌腸封口→煮制成型(常壓100℃水浴煮制)→冷卻→成品。

在火腿腸加工過程中肉糜斬拌工藝階段分別加入0.1% VE、茶多酚及水溶性迷迭香提取物液到肉糜中。火腿腸采用食品級尼龍塑料腸衣(折徑45 mm)灌裝,每只灌裝量約50 g,之后將火腿腸分成3 組,每組5 只火腿腸,沸水煮制35 min,然后用室溫自來水冷卻,冷卻結(jié)束后進行輻照處理,立即運回實驗室測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 火腿腸輻照處理

加工后的火腿腸,立即運往湖北省農(nóng)業(yè)科院輻照實驗中心進行輻照處理(60Co-γ 輻照源,活度1.1×1016Bq),靜態(tài)常溫下輻照,輻照劑量為3 kGy,輻照劑量用丙氨酸放射計量測定劑跟蹤測定,實測值為2.9 kGy。輻照結(jié)束后,立即將火腿腸轉(zhuǎn)運到實驗室進行輻照異味強度感官評價、硫代巴比妥酸反應(yīng)底物值(thiobarbituric acid reactive substances,TBARs)及蛋白羰基值的測定,每個指標(biāo)的測定平行進行3 次。

1.5 豬肉火腿腸TBARs 值的測定

取2 g 切碎的火腿腸樣品于50 mL 離心管,加入20 mL 20% 三氯乙酸溶液(trichloracetic acid,TCA)和10 mL 蒸餾水,用高速勻漿機勻漿60 s,然后靜置1 h,于4℃條件下2 000×g 離心10 min,過濾取上清液,用蒸餾水定容至50 mL。取2 mL 濾液于玻璃試管中,加入2 mL 0.02 mol·L-1硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)在沸水浴中反應(yīng)20 min,變色后取出用流動水冷卻5 min,測定其在532 nm 波長處的吸光度值。對照組：20 mL 20% TCA 用雙蒸餾水定容到50 mL,然后取2 mL 濾液加2 mL TBA,同樣也經(jīng)過上述變色反應(yīng)后冷卻,測定其相同波長下的吸光度值。根據(jù)丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出TBA 值,以每千克肉中丙二醛的毫克數(shù)來表示。

1.6 豬肉火腿腸蛋白羰基值的測定

蛋白羰基值通過2,4-二硝基苯肼衍生化處理后進行測定,參照J(rèn)ongberg 等[18]的方法并略作修改。取1.5 mL 離心管,加入0.1 mL 蛋白質(zhì)提取物溶液和0.5 mL 10 mmol·L-1溶解在2.0 mol·L-1HCl 溶液中的2,4-二硝基苯肼溶液(對照組中不加2,4-二硝基苯肼,直接加0.5 mL 2.0 mmol·L-1的鹽酸溶液),37℃下反應(yīng)1 h,期間每隔10 min 振搖一次,然后加入325 μL 50%TCA 溶液,振搖30 s 后進行冰浴10 min,2 300×g 離心10 min,棄上清液。過量的2,4-二硝基苯肼用1.0 mL溶解在10 mmol·L-1HCl 溶液中的乙醇-乙酸乙酯溶液(1 ∶1,v/v)洗滌,振搖使其反應(yīng)10 min,2 300×g 離心10 min,棄上清液,洗滌重復(fù)3 次。洗滌結(jié)束后,過量的洗滌溶劑用空氣吹干,將蛋白質(zhì)提取物懸浮于1 mL 6 mol·L-1鹽酸胍溶液(溶解于20 mmol·L-1pH 值2.3 磷酸二氫鉀緩沖液)中,在37℃條件下水浴保溫30 min,然后2 300×g 離心10 min,取上清液,測定其在280 nm 和370 nm 波長處的吸光度值。按照公式計算蛋白質(zhì)羰基衍生物的含量(nmol·mg-1protein)：

式中,Chydrazone為苯腙化合物的濃度；Cprotein為蛋白質(zhì)濃度；A370為反應(yīng)液在370 nm 處的吸光度值；A280為反應(yīng)液在280 nm 處的吸光度值；22 000 為苯腙化合物在370 nm 的摩爾吸光系數(shù),M-1cm-1。

1.7 輻照異味感官評定

挑選10 位經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的異味評價員(5 男,5 女,年齡23～26 歲)組成異味評價小組來判別輻照異味強度。不同輻照劑量的樣品被切成20 份同等大小的1 cm3小塊,在每個貯藏時間節(jié)點分別發(fā)給10 位異味評價員。其中,每約5 g 的肉樣放置于一次性無菌塑料管內(nèi),并用3 位數(shù)隨機編碼每個試驗管,經(jīng)過密封處理之后樣品管置于室溫下移交給每位評價人員。評價員事先對輻照豬肉的特征進行熟悉后,按照七分制對輻照豬肉和對照組豬肉的異味強度進行異味評分：0 代表沒有異味(none)、1 ～3 代表有輕微異味(slightly)、4～5 代表有中度異味(moderately)、6 ～7 則代表有顯著異味(extremely)。評價員在熟悉本評分制度和所有特征強度的跨度之后,填寫評價問卷并記錄隨機樣品的異味強度得分。每位人員嗅聞3 次后記錄平行測定值,所有評價人員在整個評價過程中保持安靜以避免可能帶來的絕對干擾誤差。

1.8 豬肉火腿腸菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2-2010[19],結(jié)果以log(CFU·g-1)表示。

1.9 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

選取迷迭香濃度、輻照劑量和儲藏溫度為試驗因子,根據(jù)Design-Expert 中的Box-Behnken 試驗設(shè)計原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計對輻照豬肉火腿腸儲藏品質(zhì)工藝條件進行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗設(shè)計水平及編碼見表1。每組試驗火腿腸輻照結(jié)束后在貯藏溫度條件下儲藏2 周后進行各項理化指標(biāo)測定。

表1 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對火腿腸貯藏過程中抗氧化及輻照異味控制的影響

由圖1 可知,VE、迷迭香提取物、茶多酚3 種抗氧化劑均可以顯著清除火腿腸輻照過程中產(chǎn)生的自由基,降低產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化的程度,有效抑制了火腿腸輻照過程中異味的形成。相同濃度條件下,迷迭香提取物對火腿腸輻照過程中抗氧化效果最好,VE與茶多酚間無顯著差異。因此,選用迷迭香提取物作為制作豬肉火腿腸的抗氧化劑。

2.2 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

按照響應(yīng)曲面試驗設(shè)計方案設(shè)計原理,分析測定每組試驗樣品的羰基值、TBARs 值、輻照異味感官評分值及儲藏2 周后的菌落總數(shù)。試驗測定結(jié)果見表2。

2.2.1 輻照豬肉火腿腸的蛋白羰基值分析 對表2中有關(guān)蛋白羰基值數(shù)據(jù)進行擬合得出二次多項式回歸方程模型：

由表3 可知,上述回歸模型的擬合效果極顯著(P＜0.01),決定系數(shù)R2=0.95,表明此回歸模型可以很好地預(yù)測不同抗氧化劑濃度、輻照劑量及儲藏溫度對火腿腸貯藏過程中蛋白質(zhì)氧化的影響規(guī)律。迷迭香提取物濃度、輻照劑量對火腿腸輻照、儲藏過程中蛋白質(zhì)氧化均有極顯著影響(P＜0.01),其中,影響最大的是迷迭香提取物濃度,其次是輻照劑量,且二者之間具有顯著的交互效應(yīng)(圖2)。當(dāng)迷迭香提取物濃度較低時,隨著輻照劑量的增加,豬肉火腿腸的蛋白質(zhì)氧化水平顯著增加,但隨著迷迭香提取物濃度逐漸增大,輻照劑量對火腿腸蛋白質(zhì)氧化的影響逐漸減?。划?dāng)迷迭香

表2 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface experiment

表3 豬肉火腿腸蛋白羰基值回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis result of the regression model of protein carbonyl value in pork ham sausage

圖2 迷迭香提取物濃度與輻照劑量對火腿腸蛋白質(zhì)氧化的交互效應(yīng)Fig.2 The interaction effect of rosemary extraction concentration and irradiation dose on the protein oxidation of cooked ham

提取物添加濃度大于0.45%時,火腿腸蛋白質(zhì)氧化受輻照劑量的影響不再顯著,說明迷迭香提取物可以顯著降低輻照對火腿腸蛋白質(zhì)氧化的影響。

2.2.2 豬肉火腿腸的TBARs 值分析 對表2 中有關(guān)TBARs 值數(shù)據(jù)進行擬合得出二次多項式回歸方程模型：

由表4 可知,上述回歸模型擬合效果顯著(P ＜0.05),決定系數(shù)R2=0.98,說明擬合效果較好。迷迭香提取物濃度、輻照劑量和儲藏溫度對火腿腸輻照、儲藏過程中脂肪氧化均有顯著影響(P＜0.01),其中影響最大的是迷迭香提取物濃度,其次是輻照劑量,影響最小的是儲藏溫度,但這3 個因素之間的交互效應(yīng)均不顯著；儲藏溫度的二次項對火腿腸脂肪氧化有顯著影響(P＜0.05)。綜上,儲藏溫度對火腿腸中脂肪氧化的影響比對蛋白質(zhì)氧化的影響大。

表4 豬肉火腿腸TBARs 值回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of the regression model of TBARs value in pork ham sausage

2.2.3 輻照火腿腸異味感官評分分析 對表2 中有關(guān)輻照異味感官評分值數(shù)據(jù)進行擬合得出二次多項式回歸方程模型：

由表5 可知,上述模型的擬合效果極顯著(P ＜0.01),決定系數(shù)R2=0.98,表明迷迭香提取物濃度、輻照劑量對輻照后產(chǎn)品的輻照異味有極顯著影響(P＜0.01)。輻照異味主要是火腿腸輻照處理過程中含硫氨基酸及一些蛋白質(zhì)發(fā)生分解氧化形成一些具有特殊氣味的化合物,特別是脂肪氧化產(chǎn)生的一些揮發(fā)性化合物[20]。儲藏過程中,儲藏溫度會影響火腿腸中輻照異味化合物的穩(wěn)定性,如含硫化合物的進一步氧化分解就會對產(chǎn)品的輻照異味產(chǎn)生影響。此外,輻照劑量與儲藏溫度、迷迭香提取物濃度與輻照劑量的交互作用均對輻照后儲藏2 周火腿腸的輻照異味有顯著影響(P＜0.05)。

由圖3、圖4 可知,低輻照劑量和高迷迭香提取物濃度可有效降低火腿腸的輻照異味；在儲藏溫度較低時,輻照異味感官評價值隨著輻照劑量的増加而增加,提高儲藏溫度則會降低儲藏火腿腸的輻照異味。因此,在儲藏過程中,火腿腸經(jīng)輻照處理后,可通過適當(dāng)提高儲藏溫度加速輻照異味的去除,這可能是因為提高儲藏溫度可以促進脂質(zhì)及其氧化中間產(chǎn)物的進一步氧化,進而降低火腿腸中由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的一些輻照異味化合物的含量,使得輻照異味減弱。

表5 豬肉火腿腸輻照異味感官評分回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of the regression model of the irradiation off-odor sensory evaluation value in pork ham sausage

2.2.4 豬肉火腿腸的菌落總數(shù)分析 對表2 中有關(guān)豬肉火腿腸菌落總數(shù)數(shù)據(jù)進行擬合得出二次多項式回歸方程模型：

由表6 可知,輻照劑量是影響火腿腸儲藏過程中細菌生長的主要因素,其次是迷迭香提取物濃度；輻照劑量與迷迭香提取物濃度的交互效應(yīng)對火腿腸防腐保鮮有很好的協(xié)同效應(yīng)(圖5)。

2.2.5 豬肉火腿腸輻照異味控制工藝的優(yōu)化 以輻照異味感官評分和儲藏2 周后菌落總數(shù)最低為目標(biāo),對輻照異味控制條件進行優(yōu)化,得出最優(yōu)控制條件為：迷迭香提取物濃度0.55%、輻照劑量5.733 kGy、儲藏溫度4℃,此條件下貯藏2 周后火腿腸中總菌落數(shù)為1.253 log(CFU·g-1),輻照異味感官評分為4.30。對預(yù)測優(yōu)化工藝參數(shù)進行3 次試驗驗證,得到菌落總數(shù)平均值為1.272 log(CFU·g-1),輻照異味感官評分4.27,與預(yù)測結(jié)果相對偏差僅為1.5%和0.73%,具有較高的一致性。進一步設(shè)定對照試驗,除不添加迷迭香提取物,其他配方及處理條件均與響應(yīng)面優(yōu)化得出的最優(yōu)工藝組火腿腸完全一致,冷藏2 周后測得火腿腸的菌落總數(shù)為7.371 log(CFU·g-1)。通過比較可以得出本試驗優(yōu)化的最優(yōu)工藝在保證控制輻照異味的基礎(chǔ)上,存放2 周后菌落總數(shù)較對照樣品降低了83%。

表6 豬肉火腿腸菌落總數(shù)回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis of the colony total number regression model in park ham sausage

圖4 輻照劑量和儲藏溫度對火腿腸輻照異味的交互效應(yīng)Fig.4 The interaction effect of irradiation dose and storage temperature on the intensity of irradiation off-odor in cooked ham sausage

圖5 迷迭香提取物和輻照劑量對火腿腸菌落總數(shù)的交互效應(yīng)Fig.5 The interaction effect of irradiation dose and storage temperature on the total number of colony of cooked ham sausage

3 討論

3.1 不同抗氧化劑對輻照豬肉火腿腸的抗氧化效果

輻照會使肉品中的脂質(zhì)、水分形成大量自由基,引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等氧化分解,產(chǎn)生輻照異味。研究證實,在肉品中添加抗氧化劑可有效控制輻照過程中的氧化,防止輻照異味形成。郭淑珍等[21]在熟五花肉中分別添加茶多酚、迷迭香提取物、VE、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)和特丁基對苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)5 種抗氧化劑,然后用6 kGy 輻照劑量的γ 射線對其進行輻照處理,分析不同抗氧化劑對輻照熟五花肉的抗氧化效果,發(fā)現(xiàn)TBHQ、茶多酚的抗氧化效果最好,其次是迷迭香提取物、BHT 和VE。本研究結(jié)果表明,迷迭香提取物對輻照豬肉火腿腸的抗氧化效果要優(yōu)于茶多酚,這可能是輻照劑量不同引起的,因為不同輻照劑量可能會對天然抗氧化劑結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度影響,進而影響到其抗氧化效果。朱佳廷等[22]發(fā)現(xiàn)茶多酚對60Co-γ 射線不是很敏感,用低于7 kGy 輻照劑量的60Co-γ 射線處理,茶多酚的多酚總量不會發(fā)生明顯變化。迷迭香提取物則不同,Monica 等[23]發(fā)現(xiàn)用30 kGy 輻照劑量的γ 射線照射處理可使迷迭香提取物的抗氧化效果提升22%；廖嬋等[24]研究VE、茶多酚、迷迭香提取物對切塊干腌火腿的抗氧化效果,結(jié)果也表明迷迭香提取物對切塊干腌火腿貯藏過程中的抗氧化效果最好。綜上所述,輻照能夠提高迷迭香提取物的抗氧化效果。

3.2 抗氧化劑結(jié)合輻照對豬肉火腿腸的儲藏品質(zhì)的影響

迷迭香提取物、茶多酚2 種抗氧化劑除了具有抗氧化作用外,還有一定的抗菌作用。張澤生等[25]對迷迭香提取物的抑菌效果進行了探索性研究,發(fā)現(xiàn)用80%乙醇浸提迷迭香,其提取物對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、變型桿菌等多種細菌均具有抑制活性的作用。茶多酚又名茶單寧、茶鞣質(zhì),是茶業(yè)中多酚類物質(zhì)的總稱,包括兒茶素、黃酮化合物、花青素、酚酸等,具有良好的抗氧化和抑菌作用,被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮[26]。無論是輻照處理還是上述抗氧化劑單獨使用均對肉品具有防腐保鮮效果,但兩者結(jié)合使用對肉品進行綜合保鮮,效果會更好。范凱等[27]將茶多酚與輻照處理相結(jié)合對冷藏鱸魚進行保鮮,保鮮效果優(yōu)于茶多酚或輻照單獨處理；施帥等[28]將輻照處理和茶多酚相結(jié)合對鹽水鴨進行保鮮,結(jié)果也證明兩者結(jié)合處理可顯著提高鹽水鴨的保鮮效果；Bu 等[29]將楊梅多酚與電子束輻照結(jié)合處理黃鰭金槍魚,可以顯著提高金槍魚的冷藏保鮮效果；Hwang 等[30]認(rèn)為γ 射線輻照技術(shù)與添加抗氧化劑相結(jié)合,不僅能顯著提高肌肉香腸保鮮效果,還可以減少亞硝酸鹽的殘留。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,表明輻照技術(shù)與抗氧化劑結(jié)合應(yīng)用于肉制品的貯藏保鮮,能實現(xiàn)保鮮與減輕輻照異味的目的。

4 結(jié)論

本研究表明,VE、茶多酚、迷迭香提取物3 種抗氧化劑均能有效抑制輻照誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂肪的氧化,減少輻照異味的形成,其中,迷迭香提取物對輻照異味的控制效果最佳。優(yōu)化得到的工藝條件為：迷迭香提取物濃度0.55%、輻照劑量5.73 kGy、儲藏溫度4℃,此條件下儲藏兩周后豬肉火腿腸中的總菌落數(shù)為1.253 log(CFU·g-1),比對照組降低了83%,且輻照異味不明顯。本研究結(jié)果為即食肉制品的輻照殺菌保鮮提供了相應(yīng)的理論與技術(shù)指導(dǎo)。