薛紅霞 蔣舉衛(wèi) 李曉麗 宋曉飛 鄭金雙 閆立英 孫成振

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院,河北 昌黎 066600)

黃瓜(Cucumis sativus L.)屬葫蘆科甜瓜屬,原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū),是世界十大蔬菜作物之一,也是中國重要的經(jīng)濟(jì)類蔬菜作物[1]。盡管黃瓜的地理分布十分廣泛,但與同科的甜瓜、南瓜等作物相比,其品種遺傳基礎(chǔ)趨向單一化,變異率僅為3%～8%[2],極大地限制了其育種進(jìn)程。目前,自然突變、遠(yuǎn)緣雜交[3]、組織培養(yǎng)[4]、人工誘變[5]、基因工程[6]已成為種質(zhì)創(chuàng)新的重要手段,其中以人工誘變較為常見[7]。通常,人工誘變主要包括化學(xué)誘變、物理誘變、插入誘變等技術(shù)[8]?；瘜W(xué)誘變是指利用化學(xué)誘變劑對(duì)植物材料進(jìn)行處理,誘發(fā)遺傳物質(zhì)核酸發(fā)生變異,主要包括核酸堿基類似物、DNA 插入劑和堿基修飾劑3類,其化合物結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定性[9]。大量研究表明EMS 誘變具有效率高、負(fù)作用小、應(yīng)用廣等優(yōu)勢(shì),是當(dāng)前構(gòu)建大規(guī)模飽和突變體庫的理想誘變方法[10-12]。如Chen 等[13]基于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的高效甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變體系,獲得了節(jié)間變長(zhǎng)的水稻突變體；王瑾等[14]利用EMS 溶液誘變處理抗旱性弱的小麥花藥和幼胚愈傷組織,獲得了13 株抗旱突變體；盧銀[15]采取EMS 誘變種子1 次、EMS 誘變種子2 次及EMS 誘變花蕾結(jié)合小孢子培養(yǎng)的方法,構(gòu)建了含有4 253 個(gè)家系及其自交M2種子的大白菜突變體庫。

目前,一些作物已成功構(gòu)建了飽和的突變體庫,如擬南芥[16]、水稻[17]等,且明確了矮化、抗旱等基因的功能[18],而黃瓜突變體庫的構(gòu)建及基因功能研究起步較晚,目前大多數(shù)集中在華北型黃瓜突變體庫的構(gòu)建,如王晶等[19]構(gòu)建了可穩(wěn)定遺傳的株型、葉色、花器官以及果實(shí)等豐富變異類型的長(zhǎng)春密刺突變體庫；薛存寶[20]選定1.5%和2.0% EMS 誘變黃瓜種子,獲得了64 個(gè)重要表型突變家系；張兵[21]利用1%EMS 誘變處理黃瓜種子22 h,M2獲得了細(xì)長(zhǎng)果實(shí)、短粗果實(shí)、簇生葉等突變體。本研究以華南型黃瓜高代自交系6457為試驗(yàn)材料,通過EMS 誘變的方法構(gòu)建華南型黃瓜突變體庫,分析華南型黃瓜突變?nèi)后w的表型變異特點(diǎn),旨在拓寬黃瓜遺傳背景,為黃瓜功能基因組研究和新品種選育提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 華南型黃瓜高代自交系6457,由河北科技師范學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.1.2 試劑 甲基磺酸乙酯(EMS)購自北京華越洋生物科技有限公司。用于化學(xué)誘變劑溶劑配制的化學(xué)藥品為常規(guī)無機(jī)試劑Na2HPO4和NaH2PO4,購自北京華越洋生物科技有限公司,產(chǎn)品純度為化學(xué)純。

取Na2HPO435.82 g、NaH2PO415.605 g,各自配置500 mL 溶液,命名為A、B 液,待試驗(yàn)時(shí)再按61 ∶39配制磷酸緩沖溶液,用NaOH 溶液微調(diào)pH 值至7.0[20]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 EMS 誘變最佳處理?xiàng)l件篩選 分別設(shè)置5 個(gè)EMS 濃度梯度(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、5 個(gè)時(shí)間梯度(4、6、8、10、12 h)對(duì)黃瓜6457 種子進(jìn)行處理,其中對(duì)照組(CK)均放在蒸餾水中處理相應(yīng)的時(shí)間。每個(gè)處理組選取50 粒大小均勻、顆粒飽滿的黃瓜種子,溫湯浸種3 h 后放入10 mL 離心管中,在通風(fēng)櫥中加入相應(yīng)濃度的EMS 磷酸緩沖液,室溫?fù)u床上處理相應(yīng)時(shí)間后,用1 mol·L-1Na2S2O3沖洗種子和容器1 次,倒掉,再用0.1 mol·L-1Na2S2O3沖洗3 次,流水沖洗種子2 h,然后放入28℃恒溫箱催芽12 h,催芽結(jié)束后將種子播種于營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為1 ∶1的基質(zhì)中,統(tǒng)計(jì)并分析誘變后的種子發(fā)芽率、成苗率等,篩選EMS 誘變最佳處理?xiàng)l件[19]。

1.2.2 黃瓜突變體庫的構(gòu)建 2016年8月22日,將2 500 粒顆粒飽滿、大小均勻的黃瓜6457 種子采用選定的最佳誘變條件進(jìn)行處理,發(fā)芽后定植于河北科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。根據(jù)幼苗種植位置,進(jìn)行編號(hào)。將M1植株進(jìn)行單株自交授粉,并收獲其種子,M1一般不進(jìn)行選擇淘汰。然后從每個(gè)M1種子中選取20粒顆粒飽滿、大小均勻的黃瓜種子作為M2家系,進(jìn)行催芽育種,待植株三葉一心時(shí)每個(gè)家系選擇9 株進(jìn)行定植,定植對(duì)照組20 株,最終成活的單株構(gòu)成黃瓜突變體庫M2群體,其他處理同常規(guī)管理。

參照李錫香等[22]的方法,以野生型黃瓜6457 為對(duì)照,對(duì)突變體庫M2群體中單株的變異性狀進(jìn)行調(diào)查。主要調(diào)查項(xiàng)目為幼苗期子葉及第1 ～第3 片真葉的葉片性狀,初花期的葉片、花器官、莖、株型性狀,結(jié)果期的果實(shí)果形、果色等相關(guān)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘變劑量的篩選

由表1 可知,隨著EMS 濃度的增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng),黃瓜出芽率和成苗率均呈下降趨勢(shì),表明EMS誘變可使誘變當(dāng)代部分致死。當(dāng)EMS 處理濃度為2.0%、時(shí)間為10 h 時(shí),M1種子發(fā)芽率接近60%,但種子成苗率只有42%。為了保證獲得較大的突變?nèi)后w,同時(shí)保證一定的誘變率,最終確定1.5%EMS 處理10 h為最佳誘變處理。

用1.5%EMS 對(duì)2 500 粒飽滿的黃瓜6457 種子處理10 h,共有1 666 粒種子發(fā)芽,1 204 株幼苗成活。M1幼苗定植于日光溫室,自交留種。在M1群體的構(gòu)建中,由于植株的育性極低,僅有221 個(gè)單株收到種子,結(jié)籽率為18.4%。在M2群體的構(gòu)建中,共獲得了221 個(gè)株系的1 506 個(gè)單株,僅548 個(gè)單株收到種子,結(jié)籽率為36.3%。

表1 不同誘變處理對(duì)黃瓜M1 種子出芽率和成苗率的影響Table 1 Effects of mutagenic treatments on germination and survival rate of M1 cucumber seedlings

2.2 黃瓜突變體庫M1 群體性狀變異

2.2.1 幼苗期葉片表型變異分析 野生型黃瓜6457子葉平展,真葉不皺縮(圖1-A、B)。經(jīng)過EMS 處理后,突變體黃瓜表現(xiàn)為發(fā)芽晚、植株矮小、真葉褶皺等性狀(圖1-a)。

圖1 EMS 處理對(duì)黃瓜苗期表型的影響Fig.1 Effects of EMS treatment on cucumber seedling phenotype

2.2.2 全生育期植株表型變異分析 對(duì)突變體庫M1群體的1 204 株黃瓜植株進(jìn)行調(diào)查,共發(fā)現(xiàn)227 株有明顯變異,主要表現(xiàn)為植株矮化,節(jié)間變短(圖2-A),葉片小且卷曲皺縮(圖2-B),畸形植株(圖2-C),植株生長(zhǎng)過程卷須較多(圖2-D),植株部分葉片有雜色(圖2-E),白化、黃化植株(圖2-F、G),果實(shí)為嵌合體(圖2-H)。通過對(duì)M1自交后代的表型鑒定,發(fā)現(xiàn)葉片皺縮、葉色嵌合的表型變異不能遺傳,可能為EMS 化學(xué)藥劑傷害造成的性狀變化。

2.3 黃瓜突變體庫M2 群體性狀變異

由表2 可知,176 個(gè)突變單株出現(xiàn)38 個(gè)變異性狀,總的單株變異頻率為11.7%,其中在葉、花、果實(shí)、植株性狀等的變異株數(shù)分別為77、32、57、10,性狀變異頻率分別為5.1%、2.0%、3.8%、0.8%,分別占總變異性狀數(shù)的43.8%、18.2%、32.4%、5.7%。

2.3.1 M2子葉突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 子葉平展,橢圓形,淺綠色(圖3-A)。M2群體中苗期子葉主要表現(xiàn)為子葉黃化(圖3-B)、子葉白化(圖3-C)、子葉淺綠油亮(圖3-D)、三子葉(圖3-E)、子葉皺縮、卷曲(圖3-F)、子葉畸形(圖3-G)。

2.3.2 M2真葉突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 真葉心形五角,葉緣淺鋸齒,尖端尖,單葉互生,兩面均有刺毛,綠色(圖4-A)。M2群體中變異主要表現(xiàn)為幼苗期生長(zhǎng)點(diǎn)黃化,真葉淺黃,植株生長(zhǎng)過程中,變黃真葉逐漸恢復(fù)綠色(圖4-B)；葉色變深且油綠,葉緣為深鋸齒(圖4-C、D)；葉片卷曲褶皺且內(nèi)卷,葉色深綠(圖4-E)；真葉表現(xiàn)為葉尖端銳尖,波狀葉緣(圖4-F、G)；真葉似心形,有深鋸齒和淺鋸齒之分(圖4-H、Ⅰ)；葉近圓形,葉緣較平滑(圖4-J)。

圖2 M1 群體部分表型變異分析Fig.2 Analysis of partial mutant phenotypes in M1 plants

圖3 M2 子葉突變表型Fig.3 Mutant phenotypes of cotyledon in M2 plants

2.3.3 M2花突變表型變異分析 野生型黃瓜6457為單性花,花冠黃色,花瓣5 ～6 片,花冠裂片寬尖,雌花花萼萼片中等,具有單性結(jié)實(shí)特性(圖5-A、B、C、J)。M2花器官變異性主要表現(xiàn)為雄花花瓣數(shù)增多,花冠裂片寬圓(圖5-D)；雄花花柄較長(zhǎng)(圖5-E)；花冠表現(xiàn)為全裂(圖5-F、G)；花萼萼片突變成綠色的細(xì)窄小葉(圖5-H)；兩性花突變體(圖5-Ⅰ)；花瓣顏色變?yōu)闇\黃色(圖5-K)。

表2 M2 誘變?nèi)后w中葉、花、果實(shí)、植株性狀等的變異Table 2 Phenotypic variation of leaf, flower, fruit and plant in the M2mutagenesis population

圖4 M2 真葉突變表型Fig.4 Mutant phenotypes of euphylla in M2 pla nt s

2.3.4 M2果實(shí)突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 以主蔓結(jié)瓜為主,短棒狀,瓜長(zhǎng)約25 cm,瓜把鈍圓,瓜色淺綠均勻,瓜面稍顯光澤,不灰暗,微棱,有不太明顯的小瘤(圖6-A、B)。M2群體中變異性狀,主要表現(xiàn)為果柄變短(圖6-C、D)；果柄變長(zhǎng),約為野生型的2 倍(圖6-E、F)；瓜面平滑,無刺瘤,無蠟粉,瓜形似歐洲溫室型(圖6-G、H)；植株長(zhǎng)勢(shì)弱,突變?yōu)槊艽?刺毛細(xì)柔(圖6-Ⅰ、J)；瓜把瓶頸形突變體(圖6-K)；瓜把溜肩形突變體(圖6-L)；有的植株果實(shí)變短(圖6-M、N、O、P),果柄朝下,幾乎無刺毛(圖6-M)；瓜長(zhǎng)變短約為18 cm,瓜型為短圓筒狀(圖6-N)；瓜長(zhǎng)和瓜把都變短,小瘤刺瘤上移(圖6-O)；果實(shí)兩端寬圓,瓜把不明顯,瓜型變?yōu)闄E圓形,瓜面平滑無瘤(圖6-P)；突變體瓜把變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)型,約9 cm,瓜面有光澤且鮮亮(圖6-Q、R)；瓜長(zhǎng)變長(zhǎng),約38 cm(圖6-S)；瓜面棱溝明顯,較淺(圖6-T)；瓜瘤較明顯,瓜面略顯不平狀態(tài)(圖6-U)；刺瘤上移(圖6-Ⅴ)；刺瘤下移(圖6-W)；超級(jí)子房突變體(圖6-X)。

圖5 M2 花突變表型Fig.5 Mutant phenotypes of flower in M2 plants

2.3.5 M2株型突變表型變異分析 野生型黃瓜6457 屬無限生長(zhǎng)型,主蔓棱柱形,分枝性弱(圖7-A)。M2中株形變異性狀變異的類型主要為植株無生長(zhǎng)點(diǎn),不能夠正常生長(zhǎng)(圖7-B)；植株花打頂(圖7-C)；節(jié)間變短,植株矮小(圖7-D)；主蔓無刺毛(圖7-E)；莖變成圓柱形(圖7-F)；莖變?yōu)楸馄綘?且節(jié)間縮短(圖7-G)。

3 討論

目前EMS 已被廣泛應(yīng)用于作物誘變育種,且最佳誘變條件的確定對(duì)突變體庫的成功構(gòu)建至關(guān)重要[23-26]。本試驗(yàn)以5 個(gè)濃度梯度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)和5 個(gè)時(shí)間梯度(4、6、8、10、12 h)的組合,根據(jù)誘變后黃瓜6457 種子的發(fā)芽率、成苗率,綜合分析得出EMS 濃度是處理黃瓜種子的關(guān)鍵因子[27],最終篩選出1.5%EMS 處理10 h 為誘變處理的最適條件。張兵[21]采用1.0%EMS 對(duì)山農(nóng)5 號(hào)黃瓜種子進(jìn)行不同時(shí)間誘變處理,綜合考慮突變密度和可遺傳后代,最終確定1.0%EMS 處理22 h 為最佳誘變條件。王晶等[19]利用6 個(gè)濃度梯度和5 個(gè)時(shí)間梯度組合的EMS溶液對(duì)長(zhǎng)春密刺的黃瓜種子進(jìn)行處理,綜合分析認(rèn)為致死率26%～28%為合適的誘變條件,最終確定了1.0%EMS 處理10 h 或1.5%EMS 處理8 h 為最佳誘變條件。薛存寶[20]設(shè)置5 個(gè)EMS 濃度梯度對(duì)黃瓜649 種子進(jìn)行處理,分析出苗率,最終確定1.5%EMS和2.0%EMS 為最佳誘變條件。本研究篩選的最佳誘變條件與前人研究結(jié)果存有一定的差異,推測(cè)其可能與黃瓜的基因型有關(guān)。

圖7 M2 株型突變表型Fig.7 Mutant phenotypes of plant in M2 plants

本試驗(yàn)利用1.5%EMS 溶液處理2 500 粒黃瓜6457 種子10 h,獲得由1 204 個(gè)單株組成的黃瓜突變體庫M1群體。對(duì)植株全生育期的表型進(jìn)行田間調(diào)查,發(fā)現(xiàn)經(jīng)EMS 處理的材料,表現(xiàn)為發(fā)芽慢、植株矮小、真葉褶皺,還發(fā)現(xiàn)一些葉片皺縮、葉色嵌合、植株多卷須、矮化、黃化、白化、畸形、果實(shí)嵌合體等變異性狀,這與張兵[21]、朱娜娜[23]、陳宸[28]的研究結(jié)果相一致。對(duì)M1表型變異的植株進(jìn)行自交留種,發(fā)現(xiàn)這些表型變化在M2中不能再觀察到,進(jìn)而推斷M1植株所表現(xiàn)的變異多數(shù)是由化學(xué)要害造成的。但對(duì)M1群體進(jìn)行全生育期的初步調(diào)查仍具有重要的意義,一方面可以更好地了解誘變效果,另一方面也為M2群體的調(diào)查提供一定的依據(jù)和方向。

M1共得到221 份種子,每一份種子作為一個(gè)家系,M2共得到含有221 個(gè)家系的1 506 個(gè)單株的突變體庫,共篩選到176 個(gè)突變單株,38 個(gè)變異性狀。這些變異性狀主要包括子葉白化、子葉黃化、子葉畸形、三子葉、真葉心形、真葉近圓形、花冠全裂、花萼葉片化、瓜條圓筒狀、瓜條紡錘形、長(zhǎng)瓜把、主蔓扁平、矮化植株等。本試驗(yàn)篩選的長(zhǎng)瓜把突變體,在王晶等[19]和張兵[21]所構(gòu)建的突變體庫均有呈現(xiàn)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了一株瓜均無毛、光滑、花冠變小的較特殊的變異植株。本試驗(yàn)所構(gòu)建的黃瓜突變體庫,包含多個(gè)重要表型變異材料,加快了黃瓜種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育的進(jìn)程。

4 結(jié)論

本研究利用不同EMS 濃度在不同處理時(shí)間誘變黃瓜自交系6457 種子,根據(jù)誘變后種子的發(fā)芽率和成苗率,篩選出1.5%EMS 誘導(dǎo)10 h 為最佳誘變條件,構(gòu)建了含有221 個(gè)M2株系的黃瓜突變體庫。誘變后M1出現(xiàn)皺縮葉、葉片黃化突變體、花打頂、果實(shí)嵌合體、矮化植株、畸形植株等變異類型,表型突變頻率達(dá)到18.9%；M2植株篩選到176 個(gè)突變單株,38 種表型變異,性狀變異集中在子葉、真葉、花器官、果實(shí)、植株上,總的表型突變率達(dá)11.7%。本研究結(jié)果為黃瓜育種和功能基因組學(xué)的研究提供了重要的基礎(chǔ)材料。