王亞莉，原 翔，吳婉柳，王 璐，翟德勝，5，趙 營，6，王萌萌，王建剛，路承彪

(1.河南省無創(chuàng)性神經(jīng)調(diào)制國際聯(lián)合實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南科技大學第一附屬醫(yī)院河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，河南 洛陽 471003；4.河南中醫(yī)藥大學呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000；5.新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院流行病學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；6.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院新鄉(xiāng)市臨床精神藥理學重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種嚴重的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退和認知能力下降。神經(jīng)突觸丟失、β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成老年斑、細胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)是其主要病理學特征，AD病理生理過程還涉及神經(jīng)再生調(diào)控[1-2]。AD發(fā)病機制的核心是淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein，APP)異常加工，APP蛋白水解模式主要有2種：(1)通過α和γ分泌酶途徑產(chǎn)生非淀粉樣蛋白，釋放出胞外的可溶性淀粉樣前體蛋白-α(soluble amyloid precursor protein-α，sAPP-α) 對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用；(2)通過β和γ分泌酶的順序作用，產(chǎn)生Aβ肽，Aβ沉積形成老年斑促進AD的發(fā)生。

Numb起初被描述為果蠅感覺器官發(fā)育過程中的細胞表型決定因子，是一種單次跨膜蛋白，存在4種不同的亞型，都含有磷酸酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(phosphotyrosine binding domain，PTB)及脯氨酸富含區(qū)結(jié)構(gòu)域(proline rich region，PRR)，但結(jié)構(gòu)的長度不同。長PTB域(long phosphotyrosine binding domain，LPTB)或者短PTB域(short phosphotyrosine binding domain，SPTB)分別指含有或者缺乏11個氨基酸插入；長PRR域(long proline-rich region，LPRR)或短PRR域(short proline-rich region，SPRR)指含有或者缺乏48個氨基酸插入。Numb和Numb-like是人類2個同源基因。Numb位于14q23，由13個外顯子組成，通過剪接產(chǎn)生至少9種不同的轉(zhuǎn)錄物[2]。Numb外顯子6交替剪接產(chǎn)生不同的Numb亞型，外顯子6編碼Numb PTB結(jié)構(gòu)域中的11個氨基酸序列。Numb的模塊化結(jié)構(gòu)決定了其可作為分子連接蛋白，與激酶、內(nèi)吞蛋白、黏附分子及泛素連接酶相互作用，發(fā)揮多種生理作用[3]。Numb誘導細胞分化的重要機制之一是Numb PTB域與Numb伴侶分子(partner of numb，PON)特異性結(jié)合，產(chǎn)生不均勻分布，含有結(jié)合體的子細胞，在不對稱分裂過程中抑制Notch信號并啟動子細胞分化[3]。

Numb亞細胞的定位受到G蛋白偶聯(lián)受體和激酶包括鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶及非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)的調(diào)節(jié)[3]。Numb的降解是通過與Numb蛋白X家族E3泛素連接酶的配體(ligand of NUMB protein-X，LNX)[4]及Mdm2[5]的泛素結(jié)合，靶向轉(zhuǎn)運到蛋白酶體進行的。

1 Numb在成熟神經(jīng)元中的表達與降解

Numb不僅維持神經(jīng)干細胞和神經(jīng)元的發(fā)育，在成熟神經(jīng)元中也有表達。有條件地敲除小腦浦肯野細胞中的Numb基因，將導致運動、學習功能障礙和細胞內(nèi)mGlu1的轉(zhuǎn)運異常[6]。在小鼠前腦背側(cè)的谷氨酸能神經(jīng)元中有條件地敲除Numb及其Numb-like同源基因，小鼠將表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。因此，谷氨酸能神經(jīng)元中的Numb/Numb樣蛋白缺失會引起焦慮樣反應(yīng)[7]。

LNX可靶向調(diào)節(jié)Numb的蛋白酶體降解，有研究顯示，LNX 1/LNX 2雙基因敲除小鼠表現(xiàn)出焦慮相關(guān)行為的減少，而LNX單基因缺失的小鼠無Numb功能障礙，無學習、運動或感覺功能異常[4]。

2 Numb與神經(jīng)元分化和突觸形成

Numb 具有在2個子細胞之間不對稱分布的潛力，從而使它們能夠選擇不同的細胞表型，充當二元開關(guān)，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的不對稱分裂至關(guān)重要。PC12細胞中過表達SPTB可誘導明顯的神經(jīng)元樣分化，而過表達LPTB Numb則誘導細胞增殖[8]。有研究表明，交替pre-mRNA剪接是產(chǎn)生基因產(chǎn)物多樣性的主要機制之一。體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元突起的生長需要RNA結(jié)合基序4(RNA-binding motif 4，RBM4)，RBM4可通過調(diào)節(jié)組織特異性的pre-mRNA剪接調(diào)控細胞分化；還可通過調(diào)節(jié)Numb外顯子的選擇，促進神經(jīng)元分化和突起生長。缺乏RBM4的胚胎小鼠大腦表現(xiàn)出Numb pre-mRNA的異常剪接與神經(jīng)元突起生長缺陷，這種缺陷可被外顯子9-缺乏的Numb亞型修復(fù)[9]。神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白Rbfox3，是作用于Numb pre-mRNA編碼的1個信號適配蛋白，可以促進神經(jīng)元的分化。研究顯示，表達Numb剪接亞型，能改善Rbfox3缺失引起的神經(jīng)元分化缺陷，Rbfox3依賴的Numb交替剪接，在神經(jīng)元分化過程中起著重要作用[10]。

AD患者樹突棘的減少程度與疾病進展高度相關(guān)，且新突觸的形成是記憶和認知的關(guān)鍵[1]。Numb可以影響突觸的形成，海馬神經(jīng)元中的LPTB/LPRR Numb亞型過表達可導致神經(jīng)元突觸棘長度增加。Cdc42、Rac和Rho均是Rho家族三磷鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶的成員，Numb可與CDC42鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchang factor,GEF)、Rac GEF Tiam1和Rho GEF Kalirin相互作用，GEF通過GTP與二磷鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)交換激活Rho蛋白，通過調(diào)節(jié)肌動蛋白而在突觸形成中起關(guān)鍵作用。另外，Numb可與N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)谷氨酸受體和EphB2相互作用[11]，EphB2是突觸正?；顒铀匦瑁鳨phB2在AD大腦中表達下調(diào)[12]。

3 Numb與APP轉(zhuǎn)運

APP異常加工產(chǎn)生Aβ是AD發(fā)病的核心機制。APP及分泌酶轉(zhuǎn)運失調(diào)可顯著影響APP的加工。另外，AD患者神經(jīng)元存在內(nèi)吞功能受損，內(nèi)吞小體增大是內(nèi)吞功能受損的早期病理學表現(xiàn)。由于α分泌酶主要位于細胞膜，而β分泌酶位于酸性細胞內(nèi)區(qū)室如內(nèi)吞小體，因此，APP細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運在Aβ形成中起主要作用。

Numb是一種網(wǎng)格蛋白相關(guān)分選蛋白(clathrin associated sorting protein，CLASP)，可識別[FY] xNPx[YF]基序(x為任何氨基酸)[13]，介導了網(wǎng)格蛋白調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用。ADP核糖體化因子6(ADP ribosylation factor 6，Arf6)是GTP結(jié)合蛋白家族成員，參與非網(wǎng)格蛋白依賴的蛋白轉(zhuǎn)運。Numb在Arf6信號調(diào)節(jié)的蛋白內(nèi)吞過程中起作用[3]。

Numb羧基末端區(qū)域含保守的序列，包括天門冬氨酸(D)-脯氨酸(P)-苯丙氨酸(F)(DPF)和天門冬酰胺(N)-脯氨酸(P)-苯丙氨酸(F)(NPF)基序。DPF基序是網(wǎng)格蛋白相關(guān)的α-適配蛋白的結(jié)合位點[13]，而NPF基序與含有表皮生長因子受體通路底物15同源性結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，因此在功能上，Numb也是一個內(nèi)吞適配蛋白。

在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同Numb亞型的細胞中表達SPTB Numb，細胞表現(xiàn)出異常APP積累，而表達LPTB Numb的細胞則表現(xiàn)出APP減少。表達SPTB Numb和LPTB Numb的細胞中β和γ分泌酶的活性及APP mRNA的表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示Numb通過改變APP的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運影響APP的代謝[14]。AD患者大腦存在極性蛋白Par3缺失。Par3缺失導致α分泌酶對APP降解的下降，APP靶向轉(zhuǎn)運至內(nèi)吞小體/溶酶體，產(chǎn)生Aβ積累。Par3過表達可促進非淀粉途徑的APP加工。Par3通過干擾Numb和APP的相互作用而發(fā)揮作用[14]。另有實驗表明，攜帶APP瑞典雙突變K595N /M596L的SH-SY5Y細胞過表達SPTB Numb，增加了Aβ的產(chǎn)生，而過表達LPTB Numb降低了Aβ的產(chǎn)生，因此，不同Numb亞型差異性影響APP轉(zhuǎn)運[14]。在撤出營養(yǎng)因子引起的應(yīng)激條件下，也觀察到Numb從LPTB切換到SPTB，促進了Aβ的生成。AD小鼠(3xTg)大腦和AD患者頂葉皮質(zhì)存在SPTB Numb亞型表達增加，表明Numb亞型的變化在AD發(fā)病過程中起著一定的作用[15]。

4 Numb與細胞信號通路

AD患者多種神經(jīng)功能如突觸可塑性及神經(jīng)再生嚴重受損，而Notch信號通路可以調(diào)節(jié)突觸可塑性[16]及神經(jīng)再生[17]。Notch 1和2受體與APP存在直接相互作用[18]。與APP類似，Notch受體是α和γ分泌酶的底物，這種蛋白水解過程是信號傳導的先決條件。γ分泌酶抑制劑治療AD可導致Notch信號受損[19]。Numb與Notch信號通路密切相關(guān)，各Numb亞型對Notch信號傳導的作用也不同[20]。LPTB/SPRR Numb通過招募E3泛素連接酶Itch而促進Notch 1的泛素化[21]。γ分泌酶裂解APP 羧基末端部分結(jié)合Numb并抑制Notch[22]。

AD患者神經(jīng)元存在鈣離子失衡[23]。過表達SPTB Numb的PC12細胞誘導神經(jīng)突起生長不需要NGF，但依賴于電壓依賴性鈣通道的激活[7-8]，這些細胞及培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元更容易受到Aβ毒性的影響。此外，Aβ處理培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元可上調(diào)SPTB Numb亞型表達，提示內(nèi)源性Numb在AD相關(guān)的神經(jīng)元死亡過程中起作用[15]。穩(wěn)定高表達SPTB Numb亞型的PC 12細胞表現(xiàn)出較高的Notch活性與Notch依賴性瞬時受體電位通道6(transient receptor potential channel 6，TRPC6) 轉(zhuǎn)錄。從培養(yǎng)基中撤出營養(yǎng)因子后，TRPC6上調(diào)導致鈣失調(diào)和細胞死亡增加[24]?；蚯贸齌RPC6或Notch通路，減輕撤出營養(yǎng)因子誘導的Numb所致細胞死亡，TRPC6的差異表達與鈣信號的紊亂及撤出營養(yǎng)因子所致神經(jīng)元死亡的易感性增加相關(guān)，提示Numb參與AD神經(jīng)元鈣失衡調(diào)控。此外，Numb與細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Polo樣激酶1相互作用(polo-like kinase 1,PLK1)。AD患者的PLK1活性升高，PLK1沉默可減少Aβ誘導的神經(jīng)細胞死亡[25]。

另外，Numb在神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導中可以促進神經(jīng)元存活。研究表明，海馬神經(jīng)元中的TrkA和TrkB內(nèi)吞作用需要Numb結(jié)合伴侶及表皮生長因子受體通路底物15同源性結(jié)構(gòu)域的參與[26]。

5 Numb與神經(jīng)再生

齒狀回的顆粒下區(qū)和腦室下區(qū)存在神經(jīng)再生，腦室下區(qū)神經(jīng)再生在人類出生18個月后大部分停止，而AD患者的神經(jīng)再生能力發(fā)生改變。有實驗表明，Numb對于神經(jīng)上皮細胞架構(gòu)維護至關(guān)重要，Numb可通過調(diào)節(jié)Notch信號傳導在神經(jīng)再生中起作用[17]。Numb蛋白缺失嚴重影響室管膜完整性和腦室下區(qū)的穩(wěn)態(tài)[27]。

6 小結(jié)

體外實驗數(shù)據(jù)顯示，Numb影響神經(jīng)元分化與生長。在體實驗證據(jù)表明，SPTB Numb亞型在AD小鼠模型和人類個體中都有增加。而Numb在AD發(fā)病過程中的病理生理機制尚需要進一步實驗來證明。對AD小鼠的特異性Numb亞型的靶向干預(yù)將為揭示Numb在AD中的作用提供獨特的視野。Numb作為潛在藥物靶標或生物標志物的臨床意義仍有待未來的研究來證明。然而，進一步闡明Numb與APP相互作用的生理相關(guān)性，可以更全面地了解AD的發(fā)病機制。