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(武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)，或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮。味苦、辛、性溫，歸脾、胃、肺、以及大腸經(jīng)，具有燥濕消痰，溫中下氣除滿的功效，臨床主要用于濕滯傷中，腕痞吐瀉，腹脹便瀉，痰飲咳喘以及食積氣滯等[1]。其主要產(chǎn)地位于四川、浙江、廣西、湖北、湖南等地。在中成藥中，采用厚樸配方的多達200多種[2]。聚丙烯酞胺凝膠電泳與其它分析手段相比具有分辨率高、性能穩(wěn)定、樣品不易擴散、凝膠孔徑可調(diào)等優(yōu)點，是目前最常用的蛋白質(zhì)分子分離、分析手段。根據(jù)以上優(yōu)點，可對中藥進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以電泳圖譜來標(biāo)示中藥種的特性[3]。厚樸飲片的指紋圖譜研究對其真?zhèn)蔚蔫b定以及區(qū)分不同產(chǎn)地的厚樸飲片提供了有利條件[4-6]。

本研究考察了不同產(chǎn)地厚樸飲片的電泳指紋圖譜研究，對厚樸飲片中的蛋白質(zhì)提取進行鑒定。通過對提取液量、超聲破碎時間、超聲破碎功率、超聲破碎時間間隔進行單因素實驗以及正交試驗得出厚樸飲片提取蛋白質(zhì)的最佳方法。最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的結(jié)果，比較不同產(chǎn)地厚樸飲片的蛋白質(zhì)含量及分布的差異。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

研究材料：本研究所用不同產(chǎn)地厚樸藥材分別購于湖北省恩施GAP示范基地、四川、重慶等地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張林碧教授鑒定為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.Et Wils.)的干燥樹皮、根皮和枝皮，俗稱“紫油厚樸”。

試劑：TEMED(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，丙烯酰胺(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，冰乙酸、溴酚藍(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，甲叉雙丙烯酰胺(Fluka分裝)，磷酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，TRIS堿(DOW Chemical Company)，甘氨酸(BIOSHARP)，考馬斯亮藍G-250(Sanland Chemical Co,LTD)，過硫酸銨(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，以上試劑均為分析純。

儀器：GZX-9070M型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，JY600型電泳儀、DYCZ-40D型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

取湖北恩施利川厚樸飲片粉末1g，加20mL的樣品緩沖液后按照最佳提取蛋白質(zhì)的條件，超聲破碎提取30min，超聲間隔6s，功率250W。經(jīng)超聲破碎后于4℃條件下，3500r/mim離心20min，取上清液于EP管中，4℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2 凝膠的制備

表1 蛋白質(zhì)電泳凝膠的配制

根據(jù)參考文獻[8]，按表1配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，灌膠。

1.2.3 上樣與電泳

用20μL移液槍分別吸取20μL樣品與20μL 40%蔗糖溶液于潔凈的EP管內(nèi)，用移液槍吹打混勻后，沸水煮沸5min，用20μL微量進樣器吸取20μL緩緩注入樣品槽內(nèi)。樣品添加完畢后開始電泳，電泳開始階段控制電壓80V，待樣品全部到達分離膠后，調(diào)整電壓至120V。待溴酚藍指示劑到達距分離膠底部約1cm時，關(guān)閉電源，停止電泳。整個過程約3～4h。

1.2.4 染色與脫色

電泳結(jié)束后，取出凝膠板，小心分開上下兩塊玻璃板，取出凝膠，用直尺刮去濃縮膠，保留完整的分離膠并標(biāo)記溴酚藍前沿。將凝膠浸于考馬斯亮藍G250染色液中，染色20min左右。染色后浸于脫色液中脫色，并經(jīng)常更換脫色液，至背景清晰。

1.2.5 蛋白質(zhì)電泳圖譜分析

將染色后的凝膠用蒸餾水沖洗后小心平鋪于凝膠紫外成像分析儀內(nèi)，調(diào)整好位置以便于拍照。打開Gel-Pro analyzer分析軟件，點擊拍照按鈕拍照，由于蛋白質(zhì)電泳圖譜是可見的，所以需要適當(dāng)減少曝光率至條帶清晰。拍照后保存圖片于電腦中，繼續(xù)用Gel-Pro analyzer軟件的1D-Gel分析系統(tǒng)，進行條帶捕捉，以各譜帶光密度值OD值為縱坐標(biāo)，泳道中各譜帶的泳動距離Rf值為橫坐標(biāo)，繪制各譜帶泳動率圖譜[9]。

2 結(jié)果分析

2.1 蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜分析

pro-PAGE蛋白質(zhì)圖譜見圖1，由圖可以看出個不同產(chǎn)地的厚樸飲片蛋白質(zhì)PAGE圖譜均有明顯的條帶，且條帶的位置和條帶形狀沒有明顯的差異，其中2、4、5、條帶顯示較弱，可能是這幾種厚樸樣品中雜質(zhì)較多，導(dǎo)致其提取的蛋白質(zhì)濃度較低，致使其條帶不夠明顯。

1、2.湖北恩施利川厚樸飲片;3.蛋白質(zhì)marker;4.重慶南川厚樸; 5.為四川都江堰厚樸;6.湖北恩施雙鶴厚樸;7.湖北恩施利川厚樸 圖1 蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜

2.2 泳動率圖譜分析

Lane1、2湖北恩施厚樸飲片;Lane3蛋白質(zhì)marker;Lane4重慶南川厚樸;Lane5為四川都江堰厚樸;Lane6湖北恩施雙鶴厚樸;Lane7 湖北恩施利川厚樸 圖2 不同產(chǎn)地厚樸飲片蛋白質(zhì)譜帶泳動率圖譜

將膠板用凝膠成像紫外分析儀進行成像，用Gel-Pro analyzer軟件對各譜帶進行分析。以各譜帶光密度值OD值為縱坐標(biāo)，泳道中各譜帶的泳動距離Rf值為橫坐標(biāo)，繪制各譜帶泳動率圖結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，Lane1、2、6、7同種產(chǎn)地的厚樸飲片的泳動率差異很小，其峰高、出峰點以及峰面積都幾乎一致。蛋白質(zhì)是植物基因表達的產(chǎn)物，不同產(chǎn)地的厚樸飲片的蛋白質(zhì)電泳圖譜幾乎一致說明的這幾種不同產(chǎn)地的厚樸飲片均為同一品種，證實了不同產(chǎn)地同種物種遺傳物質(zhì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。Lane4、5不同產(chǎn)地的厚樸藥材的泳動率有明顯的差別，其峰高、出峰點以及峰面積都不一樣，可以辨別出不同產(chǎn)地的厚樸藥材。說明不同產(chǎn)地厚樸飲片含有不相同類型的蛋白質(zhì)，證明蛋白質(zhì)電泳可以部分分辨不同產(chǎn)地的厚樸飲片。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)的提取是中藥指紋圖譜構(gòu)建中重要的一環(huán)，在實驗最開始的蛋白質(zhì)電泳中，由于提取出的蛋白質(zhì)含量過低，導(dǎo)致無法跑出達到要求的電泳圖譜。因此進行三因素三水平的正交試驗選出最佳的提取條件：超聲破碎時間40min，超聲破碎時間間隔4s，超聲破碎功率360W，提取液量17.5mL，蛋白質(zhì)提取濃度達到最大為4.98μg/mL。查閱相關(guān)文獻可知達到了蛋白質(zhì)電泳的含量要求。

通過將提取的蛋白質(zhì)進行電泳實驗，得到蛋白質(zhì)電泳，可以部分分辨出不同產(chǎn)地的厚樸飲片，不同產(chǎn)地厚樸飲片蛋白質(zhì)條帶對應(yīng)的泳動率差異非常小，可以區(qū)別不同產(chǎn)地的厚樸飲片為不同一品種。