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(延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002)

由于人們生活水平的不斷提高，使得人們對(duì)美的追求也越來越高，化妝品已成為日常生活的必需品。隨著回歸自然呼聲的高漲，以植物提取物為功效成分的化妝品越來越受大眾的青睞[1]，約72.9%的化妝品會(huì)添加植物成分[2-3]。本實(shí)驗(yàn)選取常用美白中藥人參，采用體外酪氨酸酶抑制法篩選出人參皂苷為美白劑，在美白的基礎(chǔ)上，通過添加絲瓜汁作為保濕劑、抗氧化劑等功效成分，研制出一款復(fù)方美白潤(rùn)膚霜。

1 儀器和試劑

主要試劑：蒸餾水；香草醛，遼寧泉瑞試劑有限公司；人參皂苷Re(批號(hào)1103B021)，北京索萊寶科技有限公司；L-酪氨酸，上海源葉生物科技有限公司；酪氨酸酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：FA-2004電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科技儀器有限公司；ZK-2S真空干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；榨汁攪拌機(jī)，順德市容桂區(qū)甜抗電器廠；UV-2201型紫外-可見分光光度，日本島津公司；Z-36HK高速臺(tái)式離心機(jī)，天津市醫(yī)療器械廠。

絲瓜購(gòu)于延吉千盛超市，放置于冰箱冷藏備用。人參(4年生曬參)購(gòu)于延吉市西市場(chǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人參皂苷的提取、精制及含量測(cè)定

人參100 g，粉碎過40目篩，加水熱提取，固液比為 1∶10，煎煮法提取人參皂苷所采用的溫度多為恒溫提取[4]，溫度85～90 ℃，時(shí)間2.5h。按上述條件，連續(xù)提取3次，提取完全后趁熱過濾，將3次濾液合并，用5% NaOH水溶液調(diào)pH值到8，靜置沉降得人參粗提液。

人參粗提液過 D101吸附性大孔樹脂，采用60% 的乙醇作為洗脫溶劑，收集并濃縮洗脫后即得人參皂苷粗提物40g[5]。取人參皂苷粗提物250mg，加適量蒸餾水充分溶解，過濾，加入適量氯仿反復(fù)充分萃取，棄去氯仿層；剩余溶液加1倍量水飽和正丁醇，振搖、密塞后放置過夜，棄去水層，將剩余溶液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，搖勻過濾，即得5mg/mL樣品溶液，以下簡(jiǎn)稱PGE。

人參皂苷含量測(cè)定參照2015版中國(guó)藥典[6]，以人參皂苷Re為標(biāo)準(zhǔn)品，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)定人參總皂苷的含量。

2.2 絲瓜汁的制備

將500g鮮絲瓜洗凈后研磨，用榨汁攪拌機(jī)破碎成粘稠狀，反復(fù)減壓抽濾3次，將3次所得濾液轉(zhuǎn)移至燒杯中，放入4 ～8℃冰箱保鮮備用即得，以下簡(jiǎn)稱LJ。

2.3 潤(rùn)膚霜的配制

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，擬定如下配方(表1)。

表1 人參絲瓜潤(rùn)膚霜配方Tab.1 the formula of Ginseng and Luffa whitening skin care cream

表1(續(xù))

2.3.1 潤(rùn)膚霜的制作工藝

(1)將A相預(yù)先溶解，A相攪拌加熱至85℃，保溫十分鐘至完全溶解。

(2)B相加熱至80～85 ℃，完全融化后保溫 30 min 備用。

(3)攪拌條件下將B相加入A相，攪拌約5 min，然后在65～75℃攪拌30～40 min。

(4)自然冷卻至55 ℃時(shí)加入防腐劑，香精和大麥粉，低速攪拌均勻，冷卻至室溫，放置24 h。

一般而言，這些污染物在蔬果上的殘留，與物質(zhì)本身的溶解性、疏水性、施用時(shí)間、存在于蔬菜的物質(zhì)都有關(guān)。在科學(xué)研究中，許多人研究過不同的清洗和食品加工步驟對(duì)各種農(nóng)藥殘留以及污染物去除的效率。但是，沒有發(fā)現(xiàn)存在一種“普遍適用”的方法能夠?qū)⑺械奈廴疚镉行У厝コ?。而且，即使是同一種蔬菜或者水果，使用的農(nóng)藥也不盡相同，這就更使得找到“最好的方法”只是一種奢望。

2.4 產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)

以涂抹分散性、乳化穩(wěn)定性、離心實(shí)驗(yàn)為指標(biāo)，對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[7]，每個(gè)指標(biāo)設(shè)1～10分，共30分(表2)，其綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)。

表2 產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)表Tab.2 Product evaluation index table

表2(續(xù))

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 人參皂苷提取物及絲瓜汁添加量的選擇

在硬脂酸用量為1%，單硬脂酸甘油酯用量為2.5%，甘油8%，乳化時(shí)間45 min條件下，膏劑制備中改變PGE (mL)和LJ (mL)配比的量(1∶1；1∶2；2∶1；2∶3；3∶2)選擇最適添加量。

2.5.2 硬脂酸添加量對(duì)膏劑制備的影響

在單硬脂酸甘油酯用量為2.5%，甘油8%，乳化時(shí)間45 min條件下，以硬脂酸作為單因素，選取不同水平的硬脂酸用量(1%、2%、3%、4%、5%)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定硬脂酸最佳用量。

2.5.3 單硬脂酸甘油酯對(duì)膏劑制備的影響

在硬脂酸用量為1%，甘油8%，乳化時(shí)間45 min條件下，以單硬脂酸甘油酯作為單因素，選取不同水平單硬脂酸甘油酯的用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定單硬脂酸甘油酯最佳用量。

2.5.4 甘油添加量對(duì)膏劑制備的影響

在硬脂酸用量為1%，單硬脂酸甘油酯用量為2.5%，乳化時(shí)間45 min條件下，以甘油作為單因素，選取不同水平甘油的用量(6%、8%、10%、12%、14%)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳甘油用量。

2.6 酪氨酸酶活性的測(cè)定

2.6.1 溶液的配置

參照袁陽(yáng)明[8]等人對(duì)酪氨酸酶活性的測(cè)定來配置溶液。按表3添加用量。

表3 生化酶實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置表Tab.3 Experiment conditions of the tyrosinase inhibition test

(1)酪氨酸酶活性抑制率I(%)=[(A1-AM2)-(A3-A4)〗]/(A1-A2)×100% ；(2)表中 A1為未加中藥成分的加酶混合液；A2為未加中藥成分和酶的混合液；A3為加中藥成分和酶的混合液；A4加中藥成分而未加酶的混合液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人參皂苷含量測(cè)定結(jié)果

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線以皂苷濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，回歸方程為y=0.0077x + 0.0095，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997?；貧w方差分析表明，人參皂苷含量在5～25μg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。計(jì)算得5mg/mL樣品溶液中人參皂苷含量為82.28%。

圖1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re

3.1.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液30μL，共6份，用顯色法測(cè)定吸光度，RSD 為1.18%，表明儀器精密度良好。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在0、2、4、6 h 取對(duì)照品溶液30μL，按照顯色法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品含量，RSD值為2.21%～3.67 %，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD值為1.87%，表明方法的重復(fù)性良好。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

Fig.2 Single factor experimental results map

在所設(shè)計(jì)配方中，PGE (mL):LJ (mL)較高和較低時(shí)，體系的穩(wěn)定性都會(huì)下降。隨著PGE含量的增多，涂抹感覺變差。因此，選擇PGE (mL)∶LJ (mL)為2∶1的實(shí)驗(yàn)配方進(jìn)行以后的實(shí)驗(yàn)。隨著硬脂酸的量的增加，膏體變得不穩(wěn)定，涂抹性變差。本著節(jié)約的想法，在1%和2%兩個(gè)用量中，選擇1%的用量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。單硬脂酸甘油酯的含量過多和過少，體系的穩(wěn)定性都會(huì)降低。當(dāng)單硬脂酸甘油酯的用量不斷增加，涂抹的分散性變差。因此選擇單硬脂酸甘油酯含量為2.5%進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘油含量過多和過低都會(huì)影響基質(zhì)的涂抹感覺。隨著甘油量的不斷增多，膏體變得更加油膩，使用感變差。因此選用甘油量8 %為實(shí)驗(yàn)配方的用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3 酪氨酸酶活性測(cè)定結(jié)果

取三批人參-絲瓜膏劑，每批3份，測(cè)定酪氨酸酶抑制率，結(jié)果見表4。人參絲瓜的抑制率24h為43.71±0.53%，同時(shí)測(cè)定了一個(gè)月和三個(gè)月后的酪氨酸酶抑制率，結(jié)果雖然略有波動(dòng)，但與24h并沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明人參絲瓜膏劑對(duì)酪氨酸酶抑制率在三個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定、有效。

表4 人參絲瓜膏劑酪氨酸酶抑制率(n=3)Tab.4 Inhibition rate of tyrosinase in Ginseng and Luffa gourd ointment

4 討論和結(jié)論

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含雙核銅離子的金屬酶，是黑色素合成過程中的關(guān)鍵限速酶。抑制酪氨酸酶的活性可以有效減少黑色素的生成，達(dá)到淡斑、美白的作用。人參提取物中人參皂苷具有美白活性，以生化酶法測(cè)定人參-絲瓜美白膏劑酪氨酸酶活性抑制率，三個(gè)月內(nèi)為42.77%，符合中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T1857-2007化妝品檢驗(yàn)規(guī)則的相應(yīng)規(guī)定。

人參絲瓜美白潤(rùn)膚霜為淡綠色狀膏體，粘度適中，pH 值為6.12，易涂抹，易被皮膚吸收，潤(rùn)膚護(hù)膚效果好，皮膚美白效果明顯，制備過程簡(jiǎn)單，制備條件溫和。該潤(rùn)膚霜外觀細(xì)膩，穩(wěn)定性良好，初步檢測(cè)具有一定的美白效果。本文結(jié)果可為提高基質(zhì)配方和開發(fā)更多新型醫(yī)學(xué)護(hù)膚品提供參考[9]。