楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，鐘志君，呂學(xué)斌（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

miRNA是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為20～22個(gè)核苷酸，其在基因表達(dá)調(diào)控、脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝等生理過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。miR-27是迄今發(fā)現(xiàn)與人類脂肪細(xì)胞分化相關(guān)性最強(qiáng)的miRNA之一，其過(guò)表達(dá)能夠降低LPL基因的表達(dá)量，進(jìn)而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達(dá)；miR-378與脂肪分化密切相關(guān)，其在小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化成熟后表達(dá)量明顯上調(diào)[4-5]，miR-378還可通過(guò)影響雄烯酮和糞臭素代謝而對(duì)公豬的膻味起調(diào)控作用進(jìn)而影響豬肉質(zhì)[6]。鑒于這兩種miRNA與豬肉品質(zhì)調(diào)控存在的關(guān)系，研究于2017年采用Q-PCR技術(shù)對(duì)四川省3個(gè)地方豬種和約克夏背最長(zhǎng)肌組織中miR-27a和miR-378的表達(dá)與肉質(zhì)性狀的差異進(jìn)行了研究。該研究為培育優(yōu)質(zhì)高效的新品種/配套系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集

試驗(yàn)豬只均由四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地提供。每個(gè)豬種隨機(jī)選取6頭，共計(jì)24頭，所有試驗(yàn)豬只于同一時(shí)間開(kāi)始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營(yíng)養(yǎng)水平和飼喂方式，達(dá)到9月齡時(shí)進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對(duì)應(yīng)處的背最長(zhǎng)肌組織，用于后續(xù)的肉質(zhì)相關(guān)表型指標(biāo)測(cè)定和miRNA熒光定量檢測(cè)。

1.2 肌內(nèi)脂肪含量（IMF）測(cè)定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自動(dòng)快速抽提儀進(jìn)行抽提，程序設(shè)置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個(gè)樣本獨(dú)立測(cè)定兩次。樣品處理和試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)GB/T 9695.1—2008《肉與肉制品游離脂肪含量測(cè)定》進(jìn)行。

1.3 肌纖維直徑測(cè)定

采用KD-2508型切片機(jī)（Kedee,China）制作背最長(zhǎng)肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統(tǒng)（Optec,China）采集代表性區(qū)域圖像，通過(guò)Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)樣品的肌纖維面積。

1.4 硫胺素含量測(cè)定

樣本處理和試驗(yàn)方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測(cè)定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測(cè)定

測(cè)量左胴體倒數(shù)3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計(jì)算眼肌面積。按豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范（NY/T 825—2004）方法測(cè)定并計(jì)算瘦肉率。

1.6 miR-27a和miR-378含量的測(cè)定

引物信息見(jiàn)表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過(guò)溶解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無(wú)引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次檢測(cè)含3個(gè)陰性對(duì)照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.0對(duì)性狀指標(biāo)和基因表達(dá)量進(jìn)行ANOVA分析，相關(guān)性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量

由表2可知，在4個(gè)豬種中，雅南豬肌內(nèi)脂肪含量最高（5.07%），其次為內(nèi)江豬（4.67%），約克夏豬最低（2.15%），雅南豬、內(nèi)江豬、成華豬極顯著高于約克夏豬（P＜0.01），雅南豬和內(nèi)江豬顯著高于成華豬（P＜0.05）。成華豬肌纖維直徑最?。?3.18 μm），約克夏肌纖維直徑最大（92.36 μm），約克夏豬肌纖維直徑極顯著高于3個(gè)地方豬種（P＜0.01），3個(gè)地方豬種間差異不顯著。3個(gè)地方豬種的眼肌面積在16～22 cm2之間，約克夏豬眼肌面積達(dá) 35.28 cm2，約克夏豬極顯著高于3個(gè)地方豬種（P＜0.01），3個(gè)地方豬種間差異不顯著。3個(gè)地方豬種的瘦肉率差異不顯著，均在43%～45%之間，約克夏豬的瘦肉率最高，為62.32%，極顯著高于3個(gè)地方豬種（P＜0.01）。雅南豬的硫胺素含量最高，為2.79 μg/g，其次是成華豬（1.84 μg/g），內(nèi)江豬硫胺素含量最低，為 1.11 μg/g，其次為約克夏豬，為1.20 μg/g，雅南豬顯著高于內(nèi)江豬和約克夏豬（P＜0.05），和成華豬無(wú)顯著差異，成華豬、內(nèi)江豬豬和約克夏豬之間無(wú)顯著差異。

表2 不同豬種相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量（n=6）

2.2 2種miRNA的表達(dá)水平

采用Q-PCR的方法，檢測(cè)了miR-27a和miR-378在豬背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，內(nèi)江豬的miR-27a的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為約克夏豬，最低的為雅南豬，內(nèi)江豬的miR-27a的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它3個(gè)豬種（P＜0.05），成華豬、雅南豬和約克夏豬之間差異不顯著。內(nèi)江豬miR-378相對(duì)表達(dá)量最高，其次為成華豬，最低的為雅南豬，成華豬和內(nèi)江豬極顯著高于雅南豬和約克夏豬（P＜0.01），成華豬顯著低于內(nèi)江豬（P＜0.05）。

表3 不同豬種的miR-27a、miR-378含量（n=6）

2.3 2種miRNA的表達(dá)水平與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量的相關(guān)性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉質(zhì)性狀相關(guān)指標(biāo)和基因表達(dá)量的相關(guān)性，由表4可知，miR-27a、miR-378在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量呈正相關(guān)（r肌內(nèi)脂肪含量=0.6～0.71；r硫胺素=0.1～0.3）；miR-27a、miR-378 在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負(fù)相關(guān)（r肌纖維直徑=-0.1～-0.3；r眼肌面積=-0.3～-0.4；r瘦肉率=-0.7～-0.8）。

表4 miR-27a、miR-378與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析（n=6）

3 討論

影響豬肉質(zhì)風(fēng)味的因素很多，其中肌內(nèi)脂肪含量是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味密切相關(guān)，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在4個(gè)豬種中，3個(gè)地方豬種的肌內(nèi)脂肪含量在3.76%～5.07%之間，肉質(zhì)優(yōu)良，約克夏豬的肌內(nèi)脂肪含量2.15%，極顯著低于3個(gè)地方豬種；肌纖維直徑越細(xì)，肉質(zhì)就越細(xì)嫩，研究顯示3個(gè)地方豬種的肌纖維直徑在70～80 μm之間，肉質(zhì)細(xì)嫩，約克夏豬肌纖維直徑為92.36 μm，極顯著高于3個(gè)地方豬種；胴體瘦肉率是評(píng)價(jià)胴體品質(zhì)的主要指標(biāo)，3個(gè)地方豬種的胴體瘦肉率在43%～45%之間，約克夏豬達(dá)62.32%，極顯著高于地方豬種；硫胺素是一種非常重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其熱降解是食品加工過(guò)程中風(fēng)味形成的主要途徑之一[7]，研究顯示成華豬和雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高。由本研究可知，地方豬種較外種豬肉質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為豬種培育的育種素材。

miRNA對(duì)豬肌肉發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)成華豬、雅南豬、內(nèi)江豬和約克夏豬背最長(zhǎng)肌組織中miR-27a和miR-378差異表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示背最長(zhǎng)肌組織中2個(gè)miRNA的表達(dá)水平在4個(gè)豬種中趨于一致。相關(guān)性分析顯示，2種miRNA在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量和硫胺素含量呈正相關(guān)，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，表明miR-27a和miR-378對(duì)豬肉質(zhì)具有正調(diào)控作用，而對(duì)豬胴體性能具有負(fù)調(diào)控作用，其可以影響豬肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積，為通過(guò)調(diào)控其表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉質(zhì)風(fēng)味的改善提供了可能。