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(1.中國計量大學光學與電子科技學院，杭州 310018；2.浙江清華長三角研究院；國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心，杭州 311231)

1 前言

近年來，因食品添加劑濫用帶來的食品安全問題受到人們的廣泛關注。常規(guī)的實驗室檢測技術如質譜、色譜等，結果相對準確，但多數(shù)檢測周期長、程序復雜，且儀器一般體積龐大、難以攜帶。

紙基微流控芯片[2]技術正好符合食品安全檢測技術的發(fā)展方向。該技術采用紙(濾紙、層析紙及硝酸纖維素膜等廣義上的紙材料)作為芯片制作材料以及生化分析平臺。芯片系統(tǒng)內可集成樣品制備、生物與化學反應、分離、檢測等基本操作單元，由微通道形成網(wǎng)絡，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，實現(xiàn)常規(guī)實驗室的分析功能。本研究以紙基微流控芯片為核心技術，開發(fā)了基于超低成本紙基微流控芯片的手持式食品添加劑現(xiàn)場即時檢測系統(tǒng)。

2 實驗部分

2.1 儀器

FUJI XEROX Phaser 8560DN噴蠟彩色打印機(日本富士施樂公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；DZF-6050型真空干燥儀(上海森信實驗儀器有限公司)DZQ-400/2D真空包裝機(浙江江南實業(yè)有限公司)；YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機(蘇州揚清芯片科技有限公司)；whatman?雙圈定性濾紙(杭州沃華濾紙有限公司)。

2.2 試劑

亞硝酸鈉，GR，山東西亞化學工業(yè)有限公司；對氨基苯磺酰胺，AR，北京化學試劑公司；N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽，AR，天津傲然精細化工研究所；檸檬酸，AR，天津科密歐化學試劑有限公司；間苯三酚(二水合物)，99%，上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉，AR，無錫市佳妮化工有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，sigma公司； 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，High Purity Grade，F(xiàn)luka進口分裝；雙氧水、甲醛標準品，國家標準物質中心。

檸檬酸溶液(330 mmol.L-1)：稱取6.34 g 檸檬酸溶于水并定容到100 mL容量瓶中。

亞硝酸鈉[3]指示劑1(330 mmol/L檸檬酸鈉和50 mmo/L對氨基苯磺酰胺)：稱取0.861 g對氨基苯磺酰胺，用330 mmol/L檸檬酸溶液將其溶解并定容于100 mL容量瓶中，避光保存。 亞硝酸鈉指示劑2(10 mmol/L N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽)：稱取0.13 g N-1-萘基-乙二胺鹽酸鹽溶解并，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ｋp氧水[4]指示劑1(1g/L TMB)：準確稱取20 mg TMB，用2 mL 無水乙醇溶解后，再用檸檬酸緩沖液定容到20 mL，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

雙氧水指示劑2(10mg/L HRP和0.5g/L PVP)：準確稱取10 mg HRP和0.5g PVP，用水溶解并定容至1000 mL，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。甲醛[5]指示劑1(0.1mol/L 間苯三酚)：稱取 0.81g 間苯三酚(二水合物)用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，避光保存。 甲醛指示劑2(4mol/L 氫氧化鈉)：稱取 8g 氫氧化鈉用水溶解并定容于50 mL容量瓶中。亞硝酸鈉標準溶液(1g/L)：稱取100 mg在115 ℃烘箱中恒重的亞硝酸鈉用水溶解并定容到100 mL容量瓶中。使用時，將其逐級稀釋得到1、2.5、5、10、20、30 mg/L一系列濃度梯度溶液。雙氧水標準溶液(30%)：使用時將雙氧水標準溶液逐級稀釋制備得到0.5、2、5、10、30mg/l一系列濃度梯度溶液。甲醛標準溶液(100mg/L)：使用時將甲醛標準溶液逐級稀釋得到0.5、1.5、3、6、10、30mg/L一系列濃度梯度溶液。

3 三維紙芯片的設計與制作3.1 紙芯片的制作

本研究所用的三維紙芯片由四層紙芯片疊加加工而成。用CAD設計芯片的結構圖案，其中，第一層為加樣、試劑固定及顯色層，此層分別為5 μL不同的食品添加劑檢測試劑2；第二層為試劑固定層，此層分別為5 μL不同的食品添加劑檢測試劑1；第三層為進樣層、第四層為輸水層。將芯片的結構圖案用噴蠟打印機打印在中速定性濾紙表面，并將濾紙上的每一個紙芯片切割開來，放入150 ℃烘烤3 min，取出在室溫冷卻，抽真空干燥。

固定好檢測試劑的紙芯片經(jīng)過如圖1(a)所示折疊，夾入兩層透明塑料膜中間，采用塑封機，塑封封裝，并在加樣口位置預先用激光雕刻機裁切出與加樣口相同直徑大小的圓孔，即得到用于食品非法添加劑檢測的三維紙芯片，成品如圖1(b)所示。

圖1 檢測芯片的組裝過程示意圖(a). 試劑在芯片上的固定位置；(b). 用于食品非法添加劑檢測的三維紙芯片成品

3.2 樣品預處理

準確稱取有代表性的肉類樣本5g，剪碎，加入10mL純凈水，振搖50次，靜置2min以上。

3.3 測試結果與分析

(1)材料選擇

考察了流體在快速、中速和慢速whatman?雙圈定性濾紙[6,7]上的流通情況，記錄不同時間流體流動達到的距離，每個實驗平行4次，流動距離取平均值，快速濾紙的流速最快，中速濾紙和慢速濾紙的流速相當，但是快速濾紙和慢速濾紙的標準偏差較大，說明這兩種濾紙的均一性較差。因此，選擇whatman?雙圈中速定性濾紙作為芯片的制作材料。

(2)芯片設計制作及穩(wěn)定性測試

所設計的微流控芯片基材為濾紙，包括噴蠟打印區(qū)、3個檢測顯色區(qū)、加樣口，外面包有一層塑料膜，其中塑料膜對應加樣口位置開口，其余地方密封，塑料膜加樣口孔徑6mm。實物尺寸約為45mm×45mm，厚度小于1mm。質量約0.8g。

3min后觀察各檢測區(qū)里的顏色強度，亞硝酸鈉、雙氧水、甲醛檢測時批內和批間相對標準偏差(RSD)值均在8%以內，穩(wěn)定性較好。

(3)標樣測定

選用亞硝酸鈉、雙氧水、甲醛作為標準樣液。將濃度分別為1、2、5、10、15、20、30 mg/L 的亞硝酸鈉標準溶液，0.5、2、5、10、15、20、25mg/L 雙氧水標準溶液，1、2、5、10、15、20、25mg/L甲醛標準溶液加入芯片中，各濃度分別測4次，自加入溶液時計時，3min后在自制檢測暗室中用手機拍照，得到的圖片用Adobe Photoshop CS6處理，芯片檢測區(qū)的灰度值(4次平均值)與食品添加劑質量濃度進行擬合，得到如圖2所示結果。

圖2 檢測芯片的標準曲線圖(a).亞硝酸鈉標準溶液質量濃度之間的擬合曲線，擬合方程為y 1= -3.1852x + 202.87；(b).雙氧水標準溶液質量濃度之間的擬合曲線擬合方程為y 2= -3.276x + 207.61；(c).甲醛標準溶液質量濃度之間的擬合曲線，擬合方程為y3 = -3.9595x + 196.94

3.4 基于智能手機的手持式比色法檢測儀

基于智能手機的手持式比色法檢測儀其基本結構包括內部照明光源及避光外殼。儀器外殼右側設有電源開關，用于控制光源；儀器正面中上部含有蓋子，打開蓋子，正好放進手機；儀器側面設有芯片插槽，供紙芯片插入并比色檢測；儀器下部右上角裝有一透鏡，與手機攝像頭位置相對。根據(jù)手機牌子與型號，透鏡位置、儀器尺寸適當調準。儀器內部主要結構包括LED光源，正對芯片放置位置，提供內部照明；還包括電池、控制芯片、電路等元件。智能手機搭載與手機兼容的檢測軟件，自動通過軟件顯示、保存檢測結果。

用噴蠟打印機打印紅(R)、綠(G)和藍(B)3種顏色卡片。分別將3種顏色的卡片放入手持式比色法檢測儀中，配合手機連續(xù)采集圖片10 次，用Adobe Photoshop CS6 分別處理3種顏色的圖片，同一位置10 次的R、G、B 值如圖4所示。R、G 和B 值10 次的相對標準偏差分別為0.2%、0.3%和0.3%，說明自制的手持式比色法檢測儀能滿足實驗檢測的要求。

圖4 手持式比色法檢測儀的穩(wěn)定性測試

4 結論

完成了一次性食品添加劑檢測紙基微流控芯片的設計加工與試劑固定，提出了將檢測試劑固定于芯片內相應區(qū)域，互不干擾；固定試劑保持反應顯色性能；采用三維結構只需一次進樣，即可完成多步分離、純化及檢測。最終基于微流控芯片在手持式檢測儀上實現(xiàn)對亞硝酸鹽、雙氧水、甲醛的現(xiàn)場、低成本、快速、便攜、準確的檢測。