甄 泉,王雅晴,冼超凡,郭衛(wèi)俊,歐陽志云

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室,北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,蚌埠 233030 4 浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,杭州 310018

細菌是空氣中微生物的主要組成部分,在地球的發(fā)展和演化中起著至關(guān)重要的作用[1]。通過大氣運動,空氣中的細菌將遙遠的生態(tài)系統(tǒng)連接起來,參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動。它們還可以吸收和反射太陽輻射,影響大氣系統(tǒng)能量收支與平衡[1]。部分細菌可作為冰核參與云的形成及降雨降雪等大氣過程[2-3]。此外,空氣中的病原細菌還可以傳播疾病,引發(fā)組織感染,威脅人群健康[4- 7]。因此,評價這些生態(tài)環(huán)境、氣候效應(yīng)和人群健康危害需要了解空氣細菌的群落特征及其動態(tài)變化。

沙塵天氣是浮塵、揚沙和沙塵暴天氣的統(tǒng)稱,是一種由大風(fēng)將地面沙塵吹(卷)起、或被高空氣流帶到下游地區(qū)而造成的一種大氣混濁現(xiàn)象[8]。在全球尺度上,沙塵天氣每年轉(zhuǎn)運的沙塵粒子可達5—50億噸[9]。其中,亞洲沙塵約貢獻20%[7]。沙塵粒子攜帶豐富多樣的細菌[9-10],從沙塵源向下游地區(qū)擴散與傳播,影響中國北方地區(qū),韓國和日本,甚至能漂洋過海抵達數(shù)千公里以外的北美大陸和法國阿爾卑斯山脈[9]。Cha等[11]研究了亞洲沙塵對首爾空氣細菌的影響,發(fā)現(xiàn)沙塵日芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、游動微菌屬(Planomicrobium)相對豐度增加,其群落結(jié)構(gòu)較非沙塵日發(fā)生了較大改變。類似的,Cha[12],Jeon[13]等人在韓國的調(diào)查和Hara[14],Lee[15],Maki[16],Yamaguchi[17]等人在日本調(diào)查均得到了沙塵能夠影響空氣細菌群落的結(jié)果。Park等[18]比較了沙塵天氣下北京與大阪空氣細菌群落的差別,發(fā)現(xiàn)北京較大阪擁有數(shù)目更多,種類更豐富的空氣細菌群落。以上研究表明,亞洲沙塵影響其下游地區(qū)空氣細菌群落,距沙塵源越近空氣細菌群落的變化程度越大。

相較于韓國、日本,我國北方地區(qū)較沙塵源更近。一些學(xué)者在戈壁沙漠[19]、敦煌[10, 20]等沙塵源區(qū)研究了沙塵日和非沙塵日空氣細菌群落的差別,但在人口密集的華北地區(qū),相關(guān)研究較少。亞洲沙塵對空氣細菌的影響研究多基于浮塵和揚沙天氣[1, 18, 21],對污染強度更大,環(huán)境及健康危害也更大的沙塵暴天氣研究較少。中國的首都北京,距沙塵源500—2500 km,每年亞洲沙塵的沉降量約為180 g/m3,是大阪的3600—36000倍[22-23],沙塵氣溶膠在大氣氣溶膠中占有較大的比重[8, 24],影響著2000萬以上常居人口的身體健康。本研究以北京市為例,采用16S rRNA高通量測序手段系統(tǒng)研究了沙塵暴前期、中期及后期空氣細菌群落的變化,旨在為更深層次的理解沙塵暴影響空氣細菌群落的方式及強度,對中國北方城市沙塵暴環(huán)境災(zāi)害的預(yù)警及相應(yīng)政策法規(guī)修訂也具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采樣地點位于中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心樓頂(40°0′31″N,116°20′34″E),2015年4月15日北京市發(fā)生了自2002年以來最大強度的沙塵暴。

采用大流量顆粒物采樣器(2031型,青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所)收集了沙塵暴前期(Before sandstorm,4月11—14日,依次記做B1—B4),沙塵暴中期(During sandstorm,4月15日,記做DS)和沙塵暴后期(After sandstorm,4月16—19日,依次記做A1—A4)的空氣總懸浮顆粒物(Total Suspended Particulate,TSP)樣本。采樣時間為10:00至次日9:00,以1.05 m3/min的流速連續(xù)采樣23 h。為避免細菌污染,玻璃纖維濾膜在采樣前使用馬弗爐500℃煅燒4 h,膜托在每天采樣前使用75%的酒精消毒。

1.2 DNA提取

將濾膜剪成條狀,置于50 mL無菌離心管中。使用滅菌1×PBS緩沖液震蕩清洗3次,懸濁液經(jīng)0.2 μm PES濾膜過濾后,剪碎并轉(zhuǎn)移至PowerBead管。65℃水浴PowerBead管10 min,Fastprep- 24快速核酸提取儀(MP Biomedicals,美國)破碎細胞。余下步驟按照PowerSoil DNA提取試劑盒(MOBIO,美國)說明書進行。

1.3 高通量測序

細菌16S rRNA基因V4高變區(qū)使用通用引物515F/806R擴增,引物在5′-端添加特異性barcode序列修飾用于區(qū)分樣本。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性30 sec；94℃變性30 sec,50℃退火30 sec,72℃延伸45 sec,共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送至測序公司,經(jīng)純化回收,等濃度混樣構(gòu)建文庫,經(jīng)Qubit定量和文庫檢測,在HiSeq2000測序平臺實施雙末端測序。

1.4 生物信息分析

初始序列拆分至各個樣本后,FLASH[25]拼接。使用Qiime[26]去除冗余序列、Usearch[27]去除singletons和chimeras。使用Mothur[28]將fasta序列與Silva參考序列對齊,預(yù)聚類降低序列中的噪音,并將所得到的高質(zhì)量序列進行分類。去除不能注釋及注釋結(jié)果為真菌、古菌、線粒體和葉綠體的序列,根據(jù)序列97%的相似度劃分操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)[29]。將Mothur生成的OTU表格轉(zhuǎn)換成biom文件,在Qiime中進一步注釋門、綱、目、科、屬各個級別的分類信息。使用R語言vegan包,按照最少序列數(shù)對OTU表格進行重抽樣。在每個樣本含量相同的基礎(chǔ)上,分析樣本的α-多樣性,通過OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù),Pielou指數(shù)體現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計分析

使用兩獨立樣本t檢驗和單樣本t檢驗對空氣細菌alpha多樣性指數(shù)進行比較；使用hellinger轉(zhuǎn)化后的OTU矩陣進行非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚類分析和主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)分析；使用adonis檢驗分析細菌群落結(jié)構(gòu)差異性；所有統(tǒng)計分析和繪圖均在R語言中完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙塵暴對空氣細菌群落α-多樣性的影響

高通量測序共獲得169122條高質(zhì)量的基因序列,每個樣本獲得8611—37719條序列。按照最小樣本量,每個樣本隨機挑取8611條序列進行α-多樣性分析(表1)。以97%序列相似度為OTU劃分標準,共獲得4208個OTU,每個樣本獲得1163—1337個OTU。沙塵暴前期,空氣細菌OTU數(shù)目、Pielou、Shannon、Simpson指數(shù)分別為1258±80、0.73±0.04、5.17±0.29和0.97±0.01,與沙塵暴后期(上述4個指數(shù)依次為1290±22、0.74±0.02、5.29±0.13和0.98±0.01)無顯著差異(P>0.05)。沙塵暴日空氣細菌含有1291個OTU,與非塵暴日(1274±53個OTU)無明顯差別(P>0.05)；而Pielou、Shannon、Simpson指數(shù)在沙塵暴日達到0.77,5.50和0.99,顯著高于非沙塵暴日的0.73±0.03、5.23±0.22和0.97±0.01(P<0.05)。

表1 空氣細菌群落的α-多樣性指數(shù)

Maki等研究發(fā)現(xiàn)戈壁沙漠腹地沙塵日和非沙塵日空氣細菌群落稀釋曲線無明顯高低[19],沙塵天氣沒有顯著增加空氣細菌的物種多樣性；而韓國首爾市的調(diào)查結(jié)果卻顯示沙塵日空氣細菌OTU數(shù)目顯著高于非沙塵日[11, 13]。調(diào)查結(jié)果的差異可能是城市距沙源地距離及受沙塵天氣影響程度不同所致。沙漠表層沙土是沙源地空氣細菌的重要來源[30],因此沙源地空氣中可能含有比較全面的沙漠細菌類群,沙塵天氣只是增加了空氣細菌的總數(shù),但沒有增加細菌的種類；而首爾市距沙塵源較遠,平時空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)受沙塵影響程度較低,即使沙塵天氣引入少量空氣細菌,也容易在濕潤的空氣沉降,不能持久懸浮在空氣中,因此沙塵天氣引入沙源細菌容易導(dǎo)致OTU數(shù)量顯著增加。沙塵暴天氣下北京市空氣細菌類群沒有顯著增加,其原因可能與戈壁等沙源地情況類似。北京市距沙塵源較近,本次沙塵暴前發(fā)生的多次沙塵天氣[31]已將沙塵細菌引入城市空氣中,它們在干燥多風(fēng)的空氣中長期懸浮,沙塵粒子可能已經(jīng)成為北京市空氣顆粒物的重要組成部分。

與首爾、大阪等地[13, 32-33]的研究結(jié)果一致,沙塵天氣下北京空氣細菌群落Shannon和Simpson指數(shù)顯著升高(P<0.05)。深入分析空氣細菌多樣性指數(shù)升高原因發(fā)現(xiàn),首爾、大阪等地沙塵日空氣細菌OTU數(shù)目顯著增加(P<0.05)均勻度(Pielou指數(shù)反映)無明顯變化(P>0.05)；而北京市正好相反,沙塵暴日空氣細菌OTU數(shù)目無明顯變化(P>0.05)均勻度顯著增加(P<0.05)。因此首爾、大阪空氣細菌綜合多樣性指數(shù)的增加主要由物種多樣性增加所致,而北京該指數(shù)的增加則更多受均勻度增加影響。北京沙塵暴空氣中細菌群落具有更高的均勻性,表明相較于沙漠這種極端環(huán)境,空氣環(huán)境對細菌的選擇壓力更大；而首爾、大阪等地沙塵日空氣細菌群落Pielou指數(shù)無明顯變化,可能是沙塵污染程度較低,空氣的選擇壓力仍然起主導(dǎo)作用導(dǎo)致。

2.2 沙塵暴對空氣細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

9個空氣細菌樣本中發(fā)現(xiàn)405個共有OTU,僅占OTU總數(shù)的7.07%,但其所代表的序列卻占據(jù)總序列的85.32%。對各樣本細菌群落分別進行門、屬水平上的群落組成分析。門水平共發(fā)現(xiàn)35個細菌門,其中,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度最高(圖1),分別占總序列的32.76%、28.09%、25.46%和6.32%。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度次之,分別占序列總數(shù)的2.11%和1.81%,其他細菌門的相對豐度均低于1%。在屬水平上(圖1),北京市空氣細菌由1120個屬構(gòu)成,其中準確注釋且相對豐度超過1%的優(yōu)勢菌屬僅有15個,庫克菌屬(Kocuria)、馬賽菌屬(Massilia)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和副球菌屬(Paracoccus)相對豐度最高,分別占總序列數(shù)的5.06%、3.63%、3.13%、2.83%和2.31%；微紅微菌屬(Rubellimicrobium)、芽生球菌屬(Blastococcus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)等10屬相對豐度在1%—2%之間。

圖1 空氣細菌群落結(jié)構(gòu)(門/屬級別)Fig.1 Community structure of airborne bacteria at phylum and genus level

深入分析沙塵暴空氣中優(yōu)勢菌群變化,門水平上(圖2)變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)顯著升高(P<0.05),分別由31.67%、5.74%、1.82%、1.51%升高至41.46%、10.98%、4.48%和4.26%；而放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)顯著降低(P<0.05),分別由28.84%、27.10%降低至22.13%和12.35%。屬水平上(圖2),馬賽菌屬(Massilia)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、微紅微菌屬(Rubellimicrobium)、斯克爾曼氏菌屬(Skermanella)、微枝形桿菌屬(Microvirga)相對豐度增加0.98%—3.47%(P<0.05)；庫克菌屬(Kocuria)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、副球菌屬(Paracoccus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、短桿菌屬(Brachybacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度降低0.21%—3.42%(P<0.05)；芽生球菌屬(Blastococcus)、貧養(yǎng)桿菌屬(Modestobacter)、地嗜皮菌屬(Geodermatophilus)在沙塵暴空氣中無顯著變化(P>0.05)。

圖2 沙塵暴中相對豐度顯著變化的優(yōu)勢細菌類群Fig.2 Abundant bacterial taxa which relative abundance significantly changed in Sandstorm

共有OTU、優(yōu)勢菌門(相對豐度≥1%)代表絕大多數(shù)空氣細菌序列,表明各樣本共有類群,尤其是優(yōu)勢類群相對豐度的差異是導(dǎo)致細菌群落結(jié)構(gòu)不同的主要原因,與2.1章節(jié)中沙塵暴日Shannon、Simpson指數(shù)增加主要受Pielou指數(shù)影響的結(jié)果一致。北京市空氣細菌由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)主導(dǎo),這四個細菌門在亞洲沙塵源(如塔克拉瑪干[34]、戈壁沙漠[19]和敦煌[10])及其下游地區(qū)(如太原[21]、北京[21]、首爾[11- 13, 21]、大阪[35])的空氣中同樣占據(jù)主導(dǎo)地位。然而沙塵天氣下,這些優(yōu)勢菌門在不同城市卻表現(xiàn)出不一致特征。

本研究中,沙塵暴天氣下,空氣變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著增加,放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度顯著降低。與戈壁沙漠空氣細菌群落[19]相比,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的變化趨勢一致,而擬桿菌門(Bacteroidetes)的變化趨勢相反；與首爾空氣細菌群落[12]相比,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)的變化趨勢相反。沙源地細菌群落特征的差異可能是研究結(jié)果不一致的首要原因。An等調(diào)查證實亞洲沙塵兩大沙源地塔克拉瑪干沙漠和戈壁沙漠表層沙粒的細菌群落差異較大[36],格爾木市、庫爾勒市沙源地變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度遠高于放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)；而敦煌和戈壁沙漠厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度最高；Katra等[37]的調(diào)查也顯示連續(xù)兩次不同沙源的沙塵暴過程,貝爾謝巴市空氣細菌群落顯著不同,表現(xiàn)出沙塵源決定空氣細菌群落的重要性。

屬水平上非沙塵天氣下庫克菌屬(Kocuria),馬賽菌屬(Massilia),冷桿菌屬(Psychrobacter),鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas),副球菌屬(Paracoccus)相對豐度最高(>2%),Du等人[38-39]的調(diào)查也顯示這些屬在北京春季具有較高的豐度。沙塵暴天氣下,菌屬的變化趨勢取決于其在沙源細菌群落中的相對豐度。顯著升高的優(yōu)勢菌屬中,馬賽菌屬(Massilia)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、微紅微菌屬(Rubellimicrobium)是戈壁、塔克拉瑪干等亞洲沙漠的優(yōu)勢菌屬,也是亞洲沙塵事件的空氣優(yōu)勢菌屬[11-12, 15-16, 21, 40]。斯克爾曼氏菌屬(Skermanella)[41]和微枝形桿菌屬(Microvirga)[12, 21]均從亞洲沙漠表層沙土中檢測到其存在。

沙塵暴天氣中相對豐度顯著升高的優(yōu)勢屬中,基本不含人類病原菌,而顯著下降的優(yōu)勢屬中,冷桿菌屬(Psychrobacter)[42],纖維單胞菌屬(Cellulomonas)[43],不動桿菌屬(Acinetobacter)[44],假單胞菌屬(Pseudomonas)[45]和梭菌屬(Clostridium)[46]可能含有人類病原菌。Cao[47]、Gao[48]、Woo[49]等人在空氣中曾檢測出鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)[48-49]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[48-49]、破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)[48]、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)[47]的存在,它們可能導(dǎo)致肺炎、呼吸道感染、皮膚感染、菌血癥,甚至引發(fā)心內(nèi)膜炎、膿胸、敗血癥等多種疾病[50]。沙塵暴天氣下,空氣細菌濃度102—103倍增[13, 17, 35],上述人類潛在病原菌相對豐度降低,而絕對豐度卻是大幅增加。加之沙塵暴降低了人體免疫力[9, 51],機會致病菌的人群健康風(fēng)險明顯增強。

2.3 沙塵暴對空氣細菌群落β-多樣性的影響

聚類分析(圖3)結(jié)果顯示,沙塵暴發(fā)生時空氣細菌群落發(fā)生顯著改變,而沙塵暴前后期空氣細菌群落比較相似；PCA分析(圖4)得到一致結(jié)果,沙塵暴日空氣細菌群落與非沙塵暴日相距較遠,沙塵暴前后空氣細菌群落更為接近。沙塵暴對空氣細菌群落的顯著影響主要體現(xiàn)在沙塵暴發(fā)生時。沙塵暴過后,沙塵粒子受重力作用自然沉降,其對空氣細菌的主導(dǎo)地位也隨之解除,空氣細菌又恢復(fù)至原來的本地土壤、水體、植物等自然源為主導(dǎo)的狀態(tài)[52]。

圖3 基于優(yōu)勢目的UPGMA聚類分析Fig.3 Hierarchical cluster analysis of abundant orders using the UPGMA method

圖4 基于所有OTU的PCA分析Fig.4 PCA analysis based on all OTUs

PCA分析(圖4)顯示,沙塵暴后期空氣細菌群落位于沙塵暴日和沙塵暴前期之間,體現(xiàn)沙塵暴后期空氣細菌群落結(jié)構(gòu)向前期恢復(fù)的趨勢。沙塵暴后期空氣細菌群落較前期變異小,可能也受到沙塵暴的影響。沙塵暴前后期空氣細菌群落沒有顯著差異(adonis檢驗,P>0.05),說明沙塵暴的對空氣細菌群落的持續(xù)影響力較弱。日本學(xué)者的調(diào)查[22, 35]發(fā)現(xiàn),中等程度亞洲沙塵天氣不能干擾大阪空氣細菌群落結(jié)構(gòu)。我們的研究進一步表明,即使是沙塵暴,也只能暫時影響空氣細菌群落,不能引起其持久變化。

3 結(jié)論

(1)利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù),系統(tǒng)研究了沙塵暴對北京市空氣細菌多樣性特征的影響。結(jié)果表明,北京市空氣細菌物種多樣性較高,沙塵暴不能引起空氣中細菌OTU數(shù)目的增加,但沙塵暴天氣下空氣細菌群落Shannon、Simpson指數(shù)的顯著增加。

(2)變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是沙塵暴中期及前后期的主導(dǎo)細菌門,沙塵暴天氣變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度顯著升高,放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度顯著降低。

(3)冷桿菌屬(Psychrobacter),纖維單胞菌屬(Cellulomonas),不動桿菌屬(Acinetobacter),假單胞菌屬(Pseudomonas)和梭菌屬(Clostridium)細菌在沙塵暴天氣相對豐度下降,但絕對豐度顯著增加。上述的菌屬可能含有人類條件病原菌,且沙塵暴能降低人體免疫力,因此沙塵暴天氣的健康風(fēng)險顯著增強。

(4)沙塵暴前后期空氣細菌OTU數(shù)目、Pielou、Shannon、Simpson指數(shù),群落結(jié)構(gòu)均無顯著差異(P<0.05),表明沙塵暴后空氣細菌迅速向原有群落結(jié)構(gòu)恢復(fù),沙塵暴只能暫時影響空氣中細菌群落特征。