高 遠(yuǎn),楊 魯,袁詩(shī)涵,徐 杰,王玉明,唐慶娟

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

由于人們對(duì)高脂高糖食物的偏愛(ài),過(guò)量攝入導(dǎo)致的胰島素抵抗、肥胖、高血脂等慢性代謝疾病越來(lái)越普遍,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。胰島素抵抗是指組織對(duì)循環(huán)胰島素的反應(yīng)變?nèi)鮗2],是2型糖尿病、肥胖癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病以及幾種癌癥的主要誘發(fā)因素[3]。高脂高糖飲食導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞緊密連接被破壞,腸道通透性增加[4],來(lái)源于腸道菌群的內(nèi)毒素(LPS)積累增加,穿過(guò)腸屏障進(jìn)入血液后可以引發(fā)慢性亞臨床炎癥過(guò)程和肥胖,進(jìn)而通過(guò)激活Toll樣受體4(TLR4)導(dǎo)致胰島素抵抗。循環(huán)短鏈脂肪酸(SCFA)的減少也可能在降低胰島素敏感性和肥胖的發(fā)生中起到重要作用[3]。

蝦青素(Astaxanthin)是一種天然的類胡蘿卜素,由四個(gè)異戊二烯單元以共軛雙鍵形式銜接,在兩端有兩個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成的六元環(huán)[5],其結(jié)構(gòu)如圖1A所示。蝦青素在自然界中廣泛分布于蝦、蟹、藻等海洋動(dòng)植物體內(nèi),具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種生理活性。已經(jīng)報(bào)道證實(shí),天然蝦青素對(duì)高脂高糖飲食導(dǎo)致的胰島素抵抗等代謝綜合征具有顯著的改善效果[6-8]。在自然界中蝦青素主要以蝦青素單酯和雙酯的形式存在,蝦青素酯是蝦青素六元環(huán)上的羥基與脂肪酸結(jié)合產(chǎn)生的,而且脂肪酸鏈分子組成復(fù)雜多樣,通常是長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸[9]。蝦青素酯的結(jié)構(gòu)如圖1B、C所示[5]。

圖1 游離態(tài)蝦青素和蝦青素酯的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of free astaxanthin and astaxanthin esters注:A為游離態(tài)蝦青素,B為蝦青素單酯,C為蝦青素雙酯。

蝦青素酯比游離態(tài)蝦青素結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[10],能夠更好地被小腸吸收,并且有更高的生物利用度和組織蓄積量[11-13]。然而,對(duì)于單一蝦青素酯的作用以及蝦青素酯結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。雨生紅球藻中的天然蝦青素,丁酸蝦青素雙酯和硬脂酸蝦青素雙酯并不是蝦青素的主要存在形式。本研究選擇具有較多活性的短鏈脂肪酸丁酸和天然蝦青素酯中連接脂肪酸最多的硬脂酸合成丁酸蝦青素雙酯和硬脂酸蝦青素雙酯,對(duì)蝦青素酯在緩解高脂高糖飲食致胰島素抵抗過(guò)程中的作用進(jìn)行探究,旨在探索比天然蝦青素活性更好的蝦青素產(chǎn)物,為蝦青素市場(chǎng)提供新的活力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用蝦青素酯,包括雨生紅球藻來(lái)源蝦青素酯(蝦青素含量38.46%,其余部分為天然植物油),丁酸蝦青素雙酯(純度84.18%),硬脂酸蝦青素雙酯(純度83.67%) 由中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送,參照楊魯?shù)萚14]的方法進(jìn)行制備,化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示;SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,5～6周齡,體重(20±2) g 購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0011;葡萄糖測(cè)定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司;血清胰島素ELISA試劑盒 武漢華美生物工程有限公司;血清內(nèi)毒素ELISA試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司;甲醛、二甲苯、氨水、酒精 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

圖2 實(shí)驗(yàn)用蝦青素酯的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of astaxanthin esters used in the study注:A為丁酸蝦青素雙酯,B為硬脂酸蝦青素雙酯。

Neofuge 23R型高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司;CP224C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;SPARK 10M酶標(biāo)儀 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;石蠟切片機(jī)Anglia Scientific，BX41光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司;1260 Infinity高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國(guó))有限公司;6890 Series氣相色譜儀 安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物建模和分組 雄性C57BL/6J小鼠暫養(yǎng)一周后根據(jù)體重隨機(jī)分成6組:正常組、模型組、溶劑對(duì)照組、藻油來(lái)源蝦青素酯組、丁酸蝦青素雙酯組、硬脂酸蝦青素雙酯組,每組10只。正常對(duì)照組喂食低脂低糖飼料(10%能量來(lái)源于脂肪,飼料配方同美國(guó)Research Diets公司#D12450J),其他組喂食高脂高糖飼料(45%能量來(lái)源于脂肪,飼料配方同美國(guó)Research Diets公司#D12451)。蝦青素酯組分別灌胃溶解在玉米油中的藻油來(lái)源蝦青素酯、丁酸蝦青素雙酯和硬脂酸蝦青素雙酯,灌胃劑量為50 mg/(kg·bw)(以純的蝦青素含量為劑量標(biāo)準(zhǔn)),每天灌胃1次,連續(xù)灌胃8周,溶劑對(duì)照組灌胃等劑量玉米油,正常組和模型組灌胃等劑量的生理鹽水。

實(shí)驗(yàn)周期為8周,喂養(yǎng)條件:溫度(22±2) ℃,濕度65%±15%。記錄實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前小鼠的初始體重和結(jié)束前小鼠的最終體重,按式(1)計(jì)算體重增長(zhǎng)率。每周記錄1次攝食量,并以8周灌胃實(shí)驗(yàn)期間通過(guò)食物攝入能量的總和,作為食物累積攝入量。收集小鼠最后一周糞便,-80 ℃保存。

體重增長(zhǎng)率(%)=(最終體重-初始體重)×100/初始體重

式(1)

1.2.2 空腹血糖及糖耐量的測(cè)定 灌胃實(shí)驗(yàn)最后一周的小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),尾靜脈取血,分離血清,根據(jù)葡萄糖試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定空腹血糖濃度。小鼠首次尾靜脈取血后立即灌胃2 g/(kg·bw)葡萄糖灌胃液,分別測(cè)定灌胃后30、60、90和120 min的血糖值,按式(2)計(jì)算血糖濃度—時(shí)間曲線下面積(area under the curve,AUC)。

AUC=15A+30B+30C+30D+15E

式(2)

其中:A、B、C、D、E分別代表0、30、60、90、120 min的血糖值。

1.2.3 血清胰島素含量的測(cè)定 灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),摘眼球取血,分離血清,采用ELISA試劑盒測(cè)定胰島素含量,并按式(3)計(jì)算胰島素抵抗指標(biāo)HOMA-IR,評(píng)價(jià)個(gè)體胰島素抵抗程度。

HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5

式(3)

1.2.4 小鼠小腸組織切片 灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食不禁水10 h(10：00 pm～8:00 am),小鼠小腸組織經(jīng)甲醛固定24 h后,經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟和包埋,制作組織切片,切片厚度5 μm。經(jīng)過(guò)脫蠟、蘇木精染料染色、氨水反藍(lán)、梯度乙醇脫水處理,伊紅染料染色,常規(guī)脫水和透明,最后用中性樹(shù)膠封片。用光學(xué)顯微鏡對(duì)小腸組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,每組隨機(jī)選取5個(gè)標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡200 倍視野下拍照,每個(gè)標(biāo)本挑選5根最長(zhǎng)并且結(jié)構(gòu)完整的絨毛,使用Image-Pro Plus 6.0軟件依次測(cè)量絨毛長(zhǎng)度(Villus length,從絨毛頂部到腸腺絨毛連接處的直線長(zhǎng)短)和隱窩深度(Crypt depth,從腸腺基部到腸腺絨毛連接處的直線長(zhǎng)度),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算小腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度(V/C)比值。

1.2.5 生物可接受率的測(cè)定 生物可接受率是指有機(jī)會(huì)可以被機(jī)體利用的量占攝入總量的百分比。小鼠單次灌胃結(jié)束后正常進(jìn)食進(jìn)水,收集24 h內(nèi)的小鼠糞便,真空冷凍干燥,研磨并充分混合均勻,然后稱取60 mg于10 mL玻璃離心管中,加入3 mL 氯仿/甲醇溶液(2∶1,v/v),渦旋5 min,靜置10 min,6000 r/min離心5 min,離心后小心吸取上層有機(jī)相,重復(fù)提取3 次,合并提取液,氮?dú)獯蹈?吹干后用1 mL甲醇/MBTE(1∶1,v/v)復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾,置于棕色樣品瓶中,于3 d內(nèi)進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析[10],實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量低溫避光操作。

參照Failla等[15-16]學(xué)者提出計(jì)算生物可接受率(Bioaccessibility)的方法,生物可接受率的計(jì)算式(4)如下:

生物可接受率(%)=(灌胃量-排泄量)×100/灌胃量

式(4)

1.2.6 糞便SCFA含量的測(cè)定 稱取糞便樣品0.2 g,加入1200 μL超純水,振蕩1 min,充分混勻。加入濃H2SO4調(diào)節(jié)pH(2～3),室溫下放置5 min,每分鐘振蕩一次,5000×g離心10 min;收集上清,取500 μL上清加入50 μL稀釋100倍的內(nèi)標(biāo)二乙基丁酸和500 μL無(wú)水乙醚,充分混勻,5000 g離心10 min;取1.0 μL乙醚層用于氣相色譜分析[17]。

1.2.7 血清LPS含量的測(cè)定 灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),摘眼球取血,分離血清,采用ELISA試劑盒測(cè)定LPS含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素酯對(duì)小鼠體重和攝食量的影響

如圖3A所示,小鼠喂養(yǎng)8周后,模型組小鼠體重增加量顯著(P<0.05),溶劑對(duì)照組小鼠體重增加量極顯著(P<0.01),分別增加了18.09%和22.13%,如圖3B所示,8周的能量攝入總量沒(méi)有顯著性差異。灌胃藻油來(lái)源蝦青素酯、丁酸蝦青素雙酯和硬脂酸蝦青素雙酯8周,體重增長(zhǎng)率和能量攝入總量與溶劑對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明蝦青素酯對(duì)小鼠的體重和能量攝入沒(méi)有顯著影響。

圖3 蝦青素酯對(duì)體重和攝食量的影響Fig.3 Effect of astaxanthin esters on body weight and food intake in insulin-resistant 注:*P<0.05,**P<0.01,與正常對(duì)照組相比差異顯著;#P<0.05,##P<0.01,與溶劑對(duì)照組相比差異顯著。圖4～圖8同、表2同。

2.2 蝦青素酯對(duì)小鼠葡萄糖耐受性的影響

葡萄糖耐受性與AUC成反比,結(jié)果見(jiàn)圖4,溶劑對(duì)照組小鼠的AUC較正常組極顯著升高(P<0.01)。灌胃蝦青素酯后,丁酸蝦青素雙酯組小鼠的空腹血糖水平下降了22.52%,曲線下面積極顯著(P<0.01)降低了17.65%,藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯相比于溶劑對(duì)照組有下降趨勢(shì),但是沒(méi)有顯著差異。結(jié)果顯示,溶劑對(duì)照組小鼠糖耐量嚴(yán)重受損,且出現(xiàn)了高血糖癥狀;丁酸蝦青素雙酯有降血糖作用,效果優(yōu)于藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯。

圖4 蝦青素酯對(duì)葡萄糖耐受性的影響Fig.4 Effect of astaxanthin esters on oral glucose tolerance in insulin-resistant 注:A圖表示小鼠灌胃葡萄糖后0、30、60、90、120 min的血糖水平;B圖表示糖耐實(shí)驗(yàn)曲線下面積。

2.3 蝦青素酯對(duì)小鼠胰島素抵抗的影響

如圖5所示,溶劑對(duì)照組小鼠血清胰島素水平和HOMA-IR極顯著(P<0.01)高于正常對(duì)照組。灌胃蝦青素酯后,丁酸蝦青素雙酯組小鼠的血清胰島素水平顯著降低了24.61%(P<0.05),HOMA-IR指數(shù)極顯著降低了46.93%(P<0.01);藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯對(duì)血清胰島素水平和HOMA-IR指數(shù)沒(méi)有顯著影響。結(jié)果顯示,溶劑對(duì)照組小鼠出現(xiàn)高胰島素血癥;丁酸蝦青素雙酯能夠顯著降低血清胰島素水平,極顯著改善小鼠的胰島素抵抗,增強(qiáng)胰島素的敏感性,效果優(yōu)于藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯。

圖5 蝦青素酯對(duì)胰島素抵抗的影響Fig.5 Effect of astaxanthin esters on insulin resistance in insulin-resistant

2.4 蝦青素酯對(duì)小鼠小腸組織形態(tài)的影響

如圖6所示,正常組小鼠腸絨毛排列緊密,結(jié)構(gòu)完整,且長(zhǎng)度較長(zhǎng);而模型組和溶劑對(duì)照組腸絨毛排列松散,長(zhǎng)度變短,顯示腸屏障功能被破壞;蝦青素酯干預(yù)組小鼠小腸組織形態(tài)得到改善,絨毛長(zhǎng)度有不同程度的增長(zhǎng)(圖7A),其中丁酸蝦青素雙酯組比溶劑對(duì)照組顯著增長(zhǎng)25.66%(P<0.05)。模型組和溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組相比絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值極顯著下降(P<0.01)(圖7B),藻油來(lái)源蝦青素酯比溶劑對(duì)照組極顯著提高42.34%(P<0.01),丁酸蝦青素酯顯著提高27.28%(P<0.05),對(duì)絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值有顯著的改善作用。

圖6 小腸HE染色圖Fig.6 Hematoxilin-eosin(HE)staining of small intestine

圖7 蝦青素酯對(duì)小腸組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of astaxanthin esters on histological structure of the small intestine in

2.5 蝦青素酯對(duì)小鼠血清中LPS的影響

如圖8所示,溶劑對(duì)照組血清LPS含量極顯著(P<0.01)高于正常對(duì)照組;灌胃蝦青素酯后,丁酸蝦青素雙酯小鼠血清內(nèi)毒素含量顯著下降了9.68%(P<0.05),藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯組小鼠血清LPS水平有下降的趨勢(shì),但差異不顯著。以上結(jié)果表明,高脂高糖飼料喂養(yǎng)喂的小鼠腸屏障破壞,細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素大量入血,機(jī)體可能出現(xiàn)慢性炎癥;丁酸蝦青素雙酯可以降低血清LPS水平,效果優(yōu)于藻油來(lái)源蝦青素酯和硬脂酸蝦青素雙酯。

圖8 蝦青素酯對(duì)胰島素抵抗小鼠血清內(nèi)毒素水平的影響Fig.8 Effect of astaxanthin esters on serum LPS levels

2.6 蝦青素酯對(duì)小鼠生物可接受率的影響

由表1可知,三種蝦青素酯的生物可接受率在10%～20%之間,三者之間沒(méi)有顯著性差異,該結(jié)果與周慶新[18]的結(jié)果相似。蝦青素酯的低生物可接受率表明,約80%的蝦青素通過(guò)結(jié)腸排出體外,這個(gè)過(guò)程中有機(jī)會(huì)與結(jié)腸中的腸道菌群接觸。據(jù)報(bào)道,蝦青素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善酒精性脂肪肝[19],而丁酸蝦青素雙酯與腸道菌群之間的作用,有待進(jìn)一步探究。

表1 蝦青素酯的生物可接受率Table 1 Bioaccessibility of astaxanthin

2.7 蝦青素酯對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸能夠增加粘蛋白的產(chǎn)生并且影響緊密連接蛋白的表達(dá)[20],對(duì)腸屏障功能有保護(hù)作用[21]。能夠激活5′-單磷酸腺苷激活蛋白激酶,改善高脂飲食小鼠胰島素抵抗和葡萄糖耐受性[22-23]。

由表2可知,高脂高糖飲食導(dǎo)致糞便中短鏈脂肪酸含量降低,其中模型對(duì)照組丙酸含量極顯著低于正常組(P<0.01)。和溶劑對(duì)照組相比,丁酸蝦青素雙酯組和硬脂酸蝦青素雙酯組提高了乙酸、異戊酸含量,但沒(méi)有顯著性差異,其中丁酸蝦青素雙酯組提高更加明顯;丁酸蝦青素雙酯顯著提高了異戊酸含量(P<0.05)。結(jié)果顯示,丁酸蝦青素雙酯在一定程度上可以提高糞便短鏈脂肪酸的含量,顯著提高異戊酸的含量。

表2 蝦青素酯對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of astaxanthin esters on fecal SCFAs in insulin-resistant

3 結(jié)論

本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)的方法建立了胰島素抵抗小鼠模型,研究了蝦青素酯對(duì)胰島素抵抗的預(yù)防和緩解作用。結(jié)果顯示,丁酸蝦青素雙酯能顯著降低血清胰島素含量(P<0.05),改善糖耐量及胰島素抵抗(P<0.01)。結(jié)果表明,連接短鏈脂肪酸的丁酸蝦青素雙酯改善胰島素抵抗的效果明顯優(yōu)于藻油來(lái)源蝦青素酯和連接長(zhǎng)鏈脂肪酸的硬脂酸蝦青素雙酯,其作用機(jī)制可能與改善腸屏障功能和調(diào)節(jié)腸道菌群產(chǎn)物L(fēng)PS和短鏈脂肪酸相關(guān)。該研究為蝦青素不同組成成分的活性研究提供理論依據(jù),對(duì)蝦青素的合成以及蝦青素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有一定的指導(dǎo)意義。