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(1.青海大學農(nóng)牧學院,青海西寧 810016; 2.青海大學農(nóng)林科學院,青海西寧 810016)

羅布麻(ApocynumvenetumL.),屬于夾竹桃科多年生宿根草本植物,分為紅麻和白麻兩種,也被稱為野麻、茶葉花、澤漆麻等[1],廣泛生長在鹽堿和沙漠等地帶,主要集中在新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、青海等地區(qū),最早在新疆羅布泊發(fā)現(xiàn),故取名為羅布麻[2]。據(jù)董正鈞[3]考證,羅布麻是一種傳統(tǒng)的藥用植物,即明代《救荒本草》中記載的澤漆,書中寫到 “采摘嫩葉,用鍋蒸,再曬干做茶吃亦可”。羅布麻茶是羅布麻的干燥葉,其飲用歷史已有3000多年[4]。相關研究證實羅布麻具有廣泛的藥理功效,如抗疲勞、降血壓及抗氧化等作用[5-6],因此其天然綠色的抗氧化、抗疲勞活性成分日益受到研究學者的青睞[7]。

隨著國內(nèi)外學者對羅布麻研究的深入,發(fā)現(xiàn)黃酮化合物是羅布麻發(fā)揮其功能作用的主要成分[8-9]。王亞寧[10]對新疆羅布麻花中的黃酮進行了研究,結果表明其黃酮具有顯著的降血脂功效;徐天資等[11]對黃秋葵黃酮采用小鼠負重游泳進行抗疲勞活性研究,發(fā)現(xiàn)黃秋葵黃酮能顯著延長小鼠負重游泳時間,具有抗運動性疲勞的作用;Geetha等[12]研究了沙棘粗黃酮的抗氧化活性,證明了沙棘中粗黃酮具有保護細胞免受氧化損傷和清除自由基的作用。

青藏高原羅布麻資源豐富,但尚未進行開發(fā)利用,青藏高原高寒缺氧,特殊生境下羅布麻化學成分積累及生物活性可能具有其獨特性。目前關于青藏高原特殊生境中羅布麻化學成分及藥理活性研究還未見報道,本論文以青海地區(qū)羅布麻茶為原料,選用不同柱色譜材料對羅布麻茶黃酮進行分離富集,并分別通過自由基清除率的測定和小鼠負重游泳試驗對其體外抗氧化活性及體內(nèi)抗疲勞作用進行評價,以期為青藏高原地區(qū)羅布麻功能性食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅布麻茶 采自青海貴德,自制成茶;SPF級昆明小鼠 雄性,體重18～22 g,購于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,合格證號:SCXK(甘)2015-0001;蘆丁(≥98%) 上海金穗生物科技有限公司;ABTS(2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 南京奧多富尼生物科技有限公司;肌糖原(MG)、肝糖原(LG)、血清尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、考馬斯亮藍、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)等測試盒 南京建成生物工程研究所;D101、D218、D315、AB-8、HPD-600、聚酰胺樹脂 江蘇長豐化工有限公司;呀啦嗦牌紅景天膠囊 青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁等 天津市富宇精細化工有限公司。

14-0807型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計 日本島津有限公司;SM600型酶標儀 上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司;ZF-1型紫外分析儀 杭州齊威儀器有限公司;H/T16MM型離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;XW-80A型漩渦混勻器 上海馳唐電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅布麻茶黃酮粗提物的制備 稱取300 g羅布麻茶,粉碎后過60目篩,按照1∶20 (g/mL)的料液比加入70%的乙醇溶液,在溫度60 ℃,功率 180 W條件下超聲提取40 min,過濾,濾液濃縮至約100 mL,加入石油醚萃取除色素,水相用乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯層,濃縮至膏狀,備用。

1.2.2 靜態(tài)吸附試驗 參考閔建華[13]的方法。分別稱取D101、D218、D315、AB-8、HPD-600、聚酰胺樹脂各5.0 g,加入50 mL羅布麻茶黃酮粗提液,搖勻,靜置吸附24 h,得到吸附液,測定黃酮含量;吸附后的樹脂加入80%乙醇溶液,解吸24 h,得到醇洗液,測定黃酮含量,分別計算吸附率和解吸率。

式(1)

式(2)

式中:c1-上樣液中黃酮的質(zhì)量濃度;V1-上樣液的體積;c2-吸附液中黃酮的質(zhì)量濃度;V2-吸附液的體積;c3-醇洗液中黃酮的質(zhì)量濃度;V3-醇洗液的體積。

1.2.3 黃酮質(zhì)量濃度的測定 參照李艷提等[14]的方法,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系顯色法。以蘆丁為標品,繪制標準曲線為y=25.165x+0.054,R2=0.9925。取0.04 g/mL羅布麻茶黃酮粗提液 1 mL置于10 mL容量瓶,加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,最后再加入4%的NaOH溶液4 mL,定容至刻度,于333 nm波長下測定吸光度值,根據(jù)標準曲線方程計算樣品中黃酮質(zhì)量濃度。

式(3)

式中:C為樣品黃酮濃度,mg/mL;V為樣液體積，50 mL;n為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量,g。

1.2.4 羅布麻茶黃酮的富集 選用靜態(tài)吸附試驗優(yōu)選的柱材料,采用濕法裝柱,將羅布麻茶黃酮粗提物沿柱壁緩慢加入,待其充分吸附后,依次用蒸餾水、30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度洗脫,每個梯度洗脫至流出液無色為止,毛細管吸取少量洗脫液點樣于濾紙上,噴涂1%三氯化鋁乙醇液顯色,置于365 nm紫外燈下觀察熒光,收集檢測斑點顯黃色的洗脫液,旋蒸濃縮至50 mL后,于-55 ℃條件下真空冷凍干燥,得羅布麻茶黃酮粉末,4 ℃保存,用于后續(xù)實驗。

1.2.4 羅布麻茶黃酮體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 ABTS自由基清除率的測定 參考Zhang Hua等[15]的方法。稱取0.197 g ABTS溶于50 mL蒸餾水中,加入過硫酸鉀,使溶液濃度達到2.4 mmol/L,在室溫、避光條件下混勻攪拌16 h后,用PBS磷酸緩沖溶液(pH=7.0)將其稀釋至734 nm處吸光度值達0.700±0.005。以VC為陽性對照,將上述羅布麻茶黃酮粉末用蒸餾水稀釋至不同濃度(0.05、0.09、0.19、0.38、1.50、3.00、6.00、12.00 mg/mL)后,分別與ABTS溶液按1∶20混勻,室溫反應6 min后,于734 nm處測定吸光值,計算公式如下:

式(4)

式中:A0為空白對照組吸光度值;A1為樣品溶液吸光度值。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率的測定 參考秦嫚嫚等[16]的方法,以VC為陽性對照,分別移取1.5 mL不同濃度的羅布麻茶黃酮樣品溶液(稀釋系列為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.70 mg/mL),加入1.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,在漩渦混勻器上搖勻,室溫、避光靜置60 min后,于518 nm處測定吸光度值,計算公式同1.2.4.1。

1.2.4.3 羥自由基清除率測定 參考Daniela等[17]的方法。將羅布麻茶黃酮樣品稀釋至不同濃度后(稀釋系列為0.0375、0.075、0.15、0.30、0.60、1.20 mg/mL),依次加入0.03% H2O2標準應用液和0.03% FeSO4溶液各0.20 mL;最后加入0.03%水楊酸乙醇溶液0.20 mL,充分混勻后,于550 nm處測定吸光值,以VC為陽性對照,計算公式同1.2.4.1。

1.2.4.4 鐵離子還原法(FRAP)試驗 參考李麗紅[18]的方法。先將NaAc-HAc緩沖液(pH=3.6,300 mmol/L)、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3溶液按體積10∶1∶1配制成FRAP工作液。分別吸取4.50 mLFRAP工作液加入到150 μL不同濃度(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)的FeSO4溶液中混合,37 ℃水浴條件下反應10 min,于593 nm處測定吸光度值,繪制標準曲線,得回歸方程為:y=0.7937x+0. 0548(R2=0.9961)。

取羅布麻茶樣品溶液將其調(diào)整為10 mg/mL,各取150 μL按上述方法進行分析測定,由標準曲線查得相同吸光值處對應的FeSO4濃度,還原力用對應的FeSO4濃度(μmol/L)表示,以95%乙醇作為空白對照,50 μg/mL VC溶液作為陽性對照,計算公式如下:

抗氧化能力=OD樣品-OD空白

式(5)

1.2.5 羅布麻茶黃酮抗疲勞活性研究

1.2.5.1 動物分組及給藥 將小鼠進行1周的適應性喂養(yǎng),溫度(24±1) ℃、濕度40%±2%,12 h光照/12 h黑暗,按嚙齒動物標準提供食物和飲用水。隨機分為空白對照組(雙蒸水)、紅景天陽性對照組(100 mg/kg bw)、羅布麻茶黃酮低、中高劑量組(50、100、200 mg/kg bw),每組10只,各組小鼠每天定時、定量灌胃一次,連續(xù)喂養(yǎng)21 d,并每周記錄小鼠體重變化情況。

1.2.5.2 負重游泳試驗 末次灌胃30 min后,在每組小鼠的尾部負荷重量為體重5%的鉛皮,將其放入水溫為(26±2) ℃、50 cm×40 cm×40 cm的水箱中游泳,直至小鼠的頭沉入水中,經(jīng)8 s后不能露出水面視為力竭,用秒表記錄小鼠從開始游泳至力竭的時間[19]。

1.2.5.3 生理生化指標的測定 小鼠負重游泳休息30 min后摘眼球取血,脫頸椎處死,解剖,取出各臟器(心、肝、脾、腎)并記錄濕重。將全血以(3500 r/min,4 ℃)離心10 min以獲取血清樣本,嚴格按照試劑盒方法測定糖原、血乳酸(LD)和血尿素氮(BUN)指標;肝組織經(jīng)生理鹽水處理后,采用考馬斯亮藍試劑盒測定其蛋白含量,并嚴格按照試劑盒操作說明測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 樹脂的篩選

以D101、D218、D315、AB-8、HPD600 5種大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂的吸附率和解吸率為考察指標。如表1所示,不同類型的樹脂極性、孔徑和比表面積不同[20],導致了對黃酮類化合物吸附強弱有差異,其中聚酰胺樹脂對黃酮吸附效果最好,吸附率達65.08%±0.26%,解吸率達41.27%±0.18%,可能是因為聚酰胺是一類高分子聚合物,結構中含有重復單位酰胺鍵(-CONH-),可以與含有酚羥基的黃酮形成氫鍵締合進而產(chǎn)生吸附作用[20]。所以優(yōu)選聚酰胺樹脂對羅布麻茶黃酮進行富集。

表1 不同樹脂對羅布麻茶黃酮的靜態(tài)吸附與解吸附性能Table 1 Absorption and desorption capabilities of different macroreticular resins to total flavoids

2.2 羅布麻茶黃酮體外抗氧化活性結果

2.2.1 羅布麻茶黃酮對ABTS+·清除率的測定 ABTS+·是一種醇液呈藍綠色的亞穩(wěn)態(tài)離子,可使黃酮類化合物褪色,且褪色程度越好,表明自由基清除能力越強,常用于機體抗氧化能力評價[21]。由圖1可知,羅布麻茶黃酮對ABTS+·清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而升高,在12 mg/mL處達到98.2%±0.16%,與同濃度下陽性對照組VC的清除效果相當,表明羅布麻茶黃酮對ABTS+·清除作用較強。

圖1 羅布麻茶黃酮對ABTS+·清除率的影響Fig.1 Effect of Apocynum venetum flavone on ABTS+· clearance rate

2.2.2 羅布麻茶黃酮對DPPH自由基清除率的測定 由圖2可知,羅布麻茶黃酮對DPPH自由基的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加而上升,當濃度達到0.20 mg/mL時對DPPH·清除率達98.5%±0.18%,優(yōu)于同濃度下陽性對照組VC,并且之后隨濃度增加,DPPH·清除率呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。

圖2 羅布麻茶黃酮對DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of Apocynum venetumflavone on DPPH· clearance rate

2.2.3 羅布麻茶黃酮對羥自由基清除率的測定 ·OH是一種對人體危害較大的活性氧自由基[22]。由圖3可知,在一定濃度范圍下,羅布麻茶黃酮對羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強,在1.20 mg/mL時清除率高達84.9%±0.21%,略低于陽性對照組VC。

圖3 羅布麻茶黃酮對羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of Apocynum venetum flavone on hydroxyl radical clearance rate

2.2.4 羅布麻茶黃酮鐵離子還原力的測定結果 由圖4可知,隨著質(zhì)量濃度的增加羅布麻茶黃酮的鐵離子還原力逐漸增加,當黃酮濃度為3.20 mg/mL時,鐵離子還原能力為(865.82±0.0)5 μmol/L FeSO4,僅與0.08 mg/mL VC的鐵離子還原力相當,可見羅布麻茶中的黃酮具有一定的鐵離子還原能力,但是作用效果與VC相比還是有較大的差距,說明羅布麻茶黃酮抗氧化作用主要表現(xiàn)在對ABTS及DPPH自由基的清除方面,這可能是羅布麻茶黃酮結構更易與自由基發(fā)生反應,而與鐵離子相互作用相對較弱的原因。

圖4 羅布麻茶黃酮對鐵離子還原力的影響Fig.4 Effect of Apocynum venetum flavone on iron ion reduction ability

2.3 羅布麻茶黃酮抗疲勞試驗結果

2.3.1 羅布麻茶黃酮對小鼠體重的影響 如表2所示,灌服不同劑量的羅布麻茶黃酮21 d后,各劑量組小鼠的體重均穩(wěn)步增長。第三周試驗結束時,各劑量組小鼠體重與空白對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表2 羅布麻茶黃酮對小鼠體重的影響Table 2 Effect of Apocynum venetum flavone on body weight of mice

2.3.2 羅布麻茶黃酮對運動后小鼠臟器濕重的影響 由表3可知,灌服不同劑量的羅布麻茶黃酮21 d后,解剖稱量各組小鼠臟器濕重,經(jīng)統(tǒng)計學分析后,各劑量組小鼠臟器濕重與空白對照組均無顯著差異(P>0.05)。表明灌胃不同劑量的羅布麻茶黃酮,并沒有對小鼠各臟器產(chǎn)生異常變化。

表3 羅布麻茶黃酮對小鼠臟器濕重的影響Table 3 Effect of Apocynum venetum flavone on wet weight of mice

2.3.3 羅布麻茶黃酮對小鼠力竭游泳時間和肝組織蛋白含量的影響 運動耐力是評價機體抗疲勞能力的重要指標,而負重游泳試驗是測定運動性疲勞程度最有效和最常用的試驗方法[23]。由表4可知,與空白對照組比較,除羅布麻茶黃酮低劑量組外,中、高劑量組小鼠負重游泳時間均有所延長,且隨著灌胃劑量的增加,小鼠游泳時間也逐漸延長,效果與灌胃劑量呈現(xiàn)正相關關系。

表4 羅布麻茶黃酮對小鼠游泳時間和肝組織蛋白含量的影響 Table 4 Effect of Apocynum venetum flavone on swimming time and protein content in liver tissue of mice

與空白對照組相比,羅布麻茶黃酮低劑量組與中劑量組均無顯著性差異,這可能與劑量選擇有關也可能與小鼠個體差異有關,尤其是羅布麻茶黃酮中劑量組,小鼠負重游泳時間最高值可達190.42 min,而最低值只有109.92 min,小鼠個體間差異較大,究竟是個體差異造成的還是劑量選擇欠佳造成的其具體機制可能需要通過大量實驗進一步深入研究。另外,灌胃不同濃度的羅布麻茶黃酮21 d后,測定小鼠肝組織蛋白含量,經(jīng)統(tǒng)計學分析后,各劑量組小鼠蛋白含量與空白對照組比均無顯著差異(P>0.05),表明羅布麻茶黃酮具有延緩運動性疲勞產(chǎn)生的作用,且藥物對小鼠肝組織蛋白無顯著影響。

2.3.4 羅布麻茶黃酮對運動后小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響 研究表明,運動引起的體力耗竭和肌糖原的消耗是同時發(fā)生的,在運動過程中,隨著肌糖原不斷被消耗,機體為了維持正常血糖水平,消耗肝糖原從而使肝糖原的含量降低[24]。由表5可知,灌胃羅布麻茶黃酮中、高劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原含量均有所上升,其中羅布麻茶黃酮高劑量組顯著高于空白對照組(P<0.05),且效果優(yōu)于陽性對照組。

表5 羅布麻茶黃酮對小鼠糖原的影響 Table 5 Effect of Apocynum venetumflavone on glycogen in mice

2.3.5 羅布麻茶黃酮對運動后小鼠全血乳酸(LD)和血清尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)的影響 運動過程中由于供氧不足,肌肉產(chǎn)生乳酸,滲透進入血液,導致血乳酸含量上升,而乳酸的減少依賴于乳酸脫氫酶的參與,它可以將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,減少乳酸的積累,從而延緩疲勞的產(chǎn)生[25]。另一方面,當機體不能通過一定的途徑獲得足夠的能量時,蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝會增強,血清尿素氮含量也隨之增加[26]。由表6可知,3個劑量組小鼠的LD含量均極顯著低于空白對照組(P<0.01),其中羅布麻茶黃酮高劑量組LD含量低于陽性對照組;且各劑量組小鼠的BUN含量也均比空白對照組低(P<0.01),其中羅布麻茶黃酮高劑量組效果更佳;而3個劑量組小鼠的LDH活力均有一定程度提高。說明羅布麻茶黃酮能夠降低運動后小鼠全血乳酸和血尿素氮含量,提高乳酸脫氫酶活力,加速乳酸的清除。

表6 羅布麻茶黃酮對小鼠LD、BUN和LDH的影響 Table 6 Effect of Apocynum venetum flavone on LD,BUN and LDH in mice

2.3.6 羅布麻茶黃酮對小鼠肝臟氧化應激指標的影響 自由基理論表明,疲勞的產(chǎn)生是由于自由基攻擊線粒體等生物膜,導致膜流動性受損和能量代謝發(fā)生紊亂,進而導致疲勞[27]。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)負責清除體內(nèi)的氧自由基,它是機體內(nèi)主要的抗氧化酶,能直接反映機體的抗氧化水平,而丙二醛是自由基引起脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,可間接顯示機體清除氧化產(chǎn)物能力和抗氧化活性[28]。如表7所示,各劑量組小鼠的SOD活性均極顯著高于空白對照組(P<0.01),其中羅布麻茶高劑量組SOD活性最高,優(yōu)于陽性對照組;并且3個劑量組小鼠的GSH-PX活性與空白對照組相比也都有所提高,其中羅布麻茶黃酮高劑量組效果最佳,GSH-PX活性極顯著高于空白對照組(P<0.01);并且3個劑量組小鼠的MDA含量都有一定程度的降低,羅布麻茶黃酮高劑量組MDA含量極顯著低于空白對照組(P<0.01)。表明羅布麻茶黃酮能提高力竭游泳后小鼠SOD和GSH-PX的抗氧化酶活性,降低MDA含量,尤其羅布麻茶黃酮高劑量組效果最佳。

表7 羅布麻茶黃酮對小鼠肝臟氧化應激指標的影響 Table 7 Effect of Apocynum venetum flavone on oxidative stress index in mice

3 結論

本論文首次對青海地區(qū)羅布麻茶黃酮進行分離富集和抗氧化、抗疲勞活性研究,發(fā)現(xiàn)聚酰胺樹脂對羅布麻茶黃酮不僅富集效果好,且得到的總黃酮抗氧化和抗疲勞活性較強,其對羅布麻茶黃酮的吸附率達65.08%、解吸率達41.27%,明顯高于其余5種大孔吸附樹脂,研究結果可為羅布麻茶黃酮富集提供一定參考。

體外抗氧化活性試驗研究發(fā)現(xiàn),當羅布麻茶黃酮濃度為0.20 mg/mL時,其對DPPH自由基清除率達98.5%±0.18%,優(yōu)于同濃度下陽性對照組VC,具有良好的抗氧化能力,具備開發(fā)成新型天然抗氧化劑的潛力?？蛊诨钚栽囼灠l(fā)現(xiàn),羅布麻茶黃酮能延長小鼠負重游泳時間,提高糖原的儲備能力,降低血清尿素氮含量,緩解肝臟氧化應激反應等,部分生化指標測定結果優(yōu)于紅景天陽性對照組,且與小鼠藥物灌胃劑量呈一定依賴關系。結合體外抗氧化活性指標推測其抗疲勞作用有可能主要通過增強氧化應激能力來實現(xiàn),羅布麻茶黃酮體外清除自由基能力越強時,體內(nèi)抗氧化酶系活力越高,越能有效地降低脂質(zhì)過氧化造成的細胞損傷,從而有效緩解疲勞。

此外,羅布麻生長在高寒缺氧地區(qū)可能會提高其耐缺氧能力,長期低氧適應性賦予其較強的抗氧化抗疲勞功能作用。青藏高原羅布麻資源豐富,本研究可為高原地區(qū)羅布麻抗氧化抗疲勞功能性食品的開發(fā)提供相應的數(shù)據(jù)支撐,促進該資源的開發(fā)利用。