宓捷波，王飛，趙孔祥，劉旸，常春艷，鄭文杰

（1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津師范大學生命科學學院，天津300387）

自20世紀90年代開始，葡萄酒作為一種承載文化和健康養(yǎng)生理念的載體逐漸受到全世界人們的青睞[1]。近年來，我國的葡萄酒消費也呈逐年上升趨勢，據(jù)海關統(tǒng)計，我國的進口葡萄酒數(shù)量幾乎以每年50%的速度飛速增長。然而，隨著大量葡萄酒的涌入，品牌混亂，價格虛高，原產地造假和品質參差不齊等問題也不斷出現(xiàn)[2]。而葡萄酒作為直接飲用的食品，其品質質量必然會直接影響飲用者的健康和體驗，因此，如何對葡萄酒進行品質產區(qū)鑒別一直是國內外學術界研究的熱點[3]。

葡萄酒的鑒別技術目前主要集中于礦質元素[2，4]、穩(wěn)定同位素[5-8]、香氣成分[9-10]和多酚類[11-12]物質的分析。其中，多酚類物質是決定葡萄酒色澤、苦味和收斂性等感官特性的重要物質[13-15]，同時其含量差異也具有品種、工藝和地區(qū)的特征，因此，多酚類物質的檢測分析對葡萄酒鑒別具有重要的意義。目前，葡萄酒中多酚類物質的檢測大多采用液相色譜法（high pressure liquid chromatograph，HPLC）[16-19]和液相色譜質譜法[20-23]，HPLC法靈敏度高、穩(wěn)定性好，但對于結構相近的多酚類物質定性和區(qū)分能力稍差，而液相色譜質譜方法定性區(qū)分能力強，應用更為廣泛。本研究借助四級桿/靜電場軌道高分辨質譜技術建立葡萄酒中13種多酚類物質的檢測方法，同時結合多元分析統(tǒng)計技術對來自不同產區(qū)國家的54批次葡萄酒的多酚類物質進行檢測和分析，通過構建判別分析模型完成了龍膽酸、香草酸、白藜蘆醇等關鍵指標函數(shù)的確立，初步實現(xiàn)了葡萄酒品質產區(qū)的鑒別，為有效監(jiān)管和分析葡萄酒產品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高壓液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜儀（配有VIM閥切換和多柱切換模塊）：美國Thermofisher公司；Avanti J-30I高速冷凍離心機：美國Beckerman Coulter公司；MS3 basic渦旋混合器、HS 501振蕩反應器：美國IKA Weake公司；Xcel VapTM自動氮吹濃縮儀：美國Horizon公司；乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸：色譜純，德國Merck公司；兒茶素、槲皮素二水合物、沒食子酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、P-香豆素、芥子酸、白藜蘆醇等標準品：美國Sigma-Aldrich公司；濃鹽酸（36%～38%）：分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學有限公司；試驗一般用水為去離子水。

1.2 樣品前處理

取1 mL葡萄酒與9 mL去離子水混合，用濃鹽酸調節(jié)pH=2，加入3 mL乙酸乙酯，振蕩提取10 min，3 500 r/min離心5 min，取上清液至15 mL離心管中，重復提取3次，合并提取液，于30℃水浴中氮吹至干，用10 mL含50%甲醇水溶液復溶。取100 μL復溶液，與900 μL含50%甲醇水溶液混合，過0.22 μm尼龍濾膜后進樣檢測。

1.3 色譜質譜條件

色譜條件：ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm），流速 0.3 mL/min，進樣量 10 μL，流動相A為含0.5%乙酸水溶液，流動相B為甲醇，洗脫程序：0～1 min，A 保持 95%，1 min～10 min，A 由 95%變化為10%，10 min～14 min，A保持95%。

質譜條件：采用全掃描（full scan）和目標離子二級掃描（Target MS2）結合方式，負離子模式，全掃描離子范圍：100 m/z～500 m/z，分辨率35 000，質量偏差0.000 5%。鞘氣流速：0.72 L/min，輔助氣流速：3.3L/min，噴霧電壓：2.75 kV，毛細管溫度：280℃，離子源加熱溫度：350℃，總碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：35 eV。高分辨質譜離子信息及碰撞能量見表1。利用全掃描結果外標法定量，Target MS2結果定性。

表1 13種多酚類物質的HPLC-QE HRMS質譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of HPLC-QE HRMS for 13 polyphenols

1.4 統(tǒng)計分析

將得到的多酚類物質的數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)若干因素對待預測對象進行分類，通過分析構建用于定性預報的數(shù)學模型，再利用構建模型之外的派生數(shù)據(jù)進行交叉驗證。

首先確立干紅-干白，新舊世界通常將歐洲等采用傳統(tǒng)技術釀制葡萄酒的產區(qū)稱為舊世界葡萄酒產區(qū)，而美洲、亞洲等采用新技術釀制葡萄酒的產區(qū)則被稱為新世界產區(qū)。歐美亞不同洲別和不同國別4個待預測類別組，利用主成分分析、偏最小二乘法等判別分析方法，以所有13種多酚成分的相對濃度含量為自變量，研究這些化合物相對含量對上述4個待預測類型組的判別能力，從中獲得表征類別差異的化合物組；借助差異化學成分構建判別模型，對數(shù)據(jù)進行模型驗證和交叉驗證。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

多酚類物質通常是具有帶一個或多個羥基的芳環(huán)結構，在負離子模式下檢測可獲得較強的質譜信號[24-25]。依據(jù)負離子模式檢測時物質離子化的特點，若流動相中含酸會抑制目標物的離子化，所以一般以水為流動相。但以甲醇和水為流動相時，多酚類物質在色譜柱上有嚴重的拖尾，而加入少量的乙酸后，多酚類物質的峰形有了明顯改善。所以為了同時兼顧多酚類物質的峰形和響應值，分別在流動相中添加0.1%、0.2%、0.5%、1.0%的乙酸進行測定，結果表明，含0.5%乙酸的水溶液與甲醇為流動相時多酚類物質的響應最佳。故最終以0.5%乙酸水與甲醇作為多酚類物質的流動相。圖1為0.5%乙酸水溶液與甲醇作為流動相時13種多酚類物質的提取離子色譜圖，峰形和響應值均可滿足分析的需要。

圖1 葡萄酒中13種多酚類物質的全掃描提取離子色譜圖Fig.1 Full scan chromatograms of 13 polyphenols in wine

2.2 方法學驗證

試驗結果顯示，13種多酚類物質在0.001 mg/L～10 mg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。以不同水平稀釋后分析化合物響應的信噪比（S/N）大于10計算方法的定量下限，得到各物質的定量下限為0.000 5 mg/L～0.002 5mg/L。文獻[16-17]研究表明，每升葡萄酒中上述多酚類物質的含量一般為mg級，所以，本方法的靈敏度可以滿足葡萄酒中多酚類物質稀釋100倍后的檢測需要。同時，方法在低、中、高添加水平的加標回收率為78.7%～109.1%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.8%～9.5%。

2.3 多酚指標對干白和干紅的判別

采用四級桿/靜電場軌道高分辨質譜技術對來自美洲、歐洲、非洲、亞洲和大洋洲的12個國家共54批次的干紅和干白葡萄酒進行13種多酚類物質的測定，對所獲得的數(shù)據(jù)以預測“干白-干紅”為目標進行分析。表2為各酚酸指標對于“干白-干紅”類別組的均值差異情況。

表2 干紅、干白的判別分析結果Table 2 Results of squares discriminant analysis based on red wine and white wine

從表2中可以看出沒食子酸、兒茶素、龍膽酸和香草酸在不同類型的葡萄酒樣品中差異很顯著（F值較大），因此在利用這些成分辨別葡萄酒的不同類型（干白或干紅）時，它們是重要的參數(shù)。

一般而言，判別分析中sig值小于0.05即可判斷為顯著水平，故本試驗中以龍膽酸和香草酸構建進一步的Fisher判別函數(shù)。

將原始數(shù)據(jù)代回上述公式中，實際樣品數(shù)據(jù)的正確率為96.2%?？梢?，利用該函數(shù)模型對干白和干紅的類別分析較為有效，與直觀的結果分析也十分一致。

2.4 多酚指標對新世界產區(qū)和舊世界產區(qū)的判別

本試驗對所獲得的數(shù)據(jù)以預測“新舊世界產區(qū)”為目標進行分析，結果見表3。

表3 新世界、舊世界產區(qū)的判別分析結果Table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

續(xù)表3 新世界、舊世界產區(qū)的判別分析結果Continue table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

結果發(fā)現(xiàn)這些指標在葡萄酒樣品中差異都不顯著（Sig值都大于0.05），因此不能夠利用這些多酚數(shù)據(jù)辨別葡萄酒的新舊世界產區(qū)。

2.5 多酚指標對洲別的判別

鑒于通常歐洲、美洲、大洋洲和其他洲之間的葡萄酒也會存在工藝、品種上的差異，因此本試驗將“洲別”也作為一個預測組，分析結果見表4。

表4 不同洲別產區(qū)的判別分析結果Table 4 Results of squares discriminant analysis based on different continents

結果發(fā)現(xiàn)龍膽酸和白藜蘆醇在不同洲別葡萄酒樣品中差異很顯著。按2.3所述構建fisher判別函數(shù)并借助方程對數(shù)據(jù)進行交叉驗證，對分組葡萄酒樣品中的55.3%進行了正確分類。所以，該模型可用于葡萄酒洲產區(qū)的初步區(qū)分。

2.6 多酚指標對國別的判別

本試驗利用同樣的判別分析方法以“國家”為預測組進行分析，結果見表5。

表5 不同國家產地的判別分析結果Table 5 Results of squares discriminant analysis based on different countries

結果顯示p-香豆素在該預測分類組的葡萄酒樣品中差異很顯著。按2.3所述構建fisher判別函數(shù)并借助方程對數(shù)據(jù)進行交叉驗證。驗證結果表明，該模型只能對以國別分組的葡萄酒樣品中的27.7%進行正確的國別分類，所以該預測組模型對于國家的區(qū)分度相對不高。

3 結論

本研究借助四級桿/靜電場軌道高分辨質譜技術建立葡萄酒中13種多酚類物質的檢測方法，并利用統(tǒng)計學方法對復雜的數(shù)據(jù)結果進行類別區(qū)分，結果表明，多酚類物質對干白、干紅的區(qū)分性很好，數(shù)學模型的吻合度非常高，對產區(qū)洲別的吻合度約50%，基本實現(xiàn)了初步區(qū)分的目的?？紤]到酒樣真實性無法確切保證，上述結果也在預期之內，但利用酚酸類物質進行分析產區(qū)的基本模式是可行的，如果在進一步的試驗中增加指標參數(shù)，再配合真實性可靠的酒樣，應該會有更好的結果。