任秀娟

（1.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東煙臺(tái)264670；2.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院糧油食品工程技術(shù)研發(fā)中心，山東煙臺(tái)264670）

根據(jù)世衛(wèi)組織研究報(bào)道，中國(guó)當(dāng)前超重人口超過(guò)3億，已成為擁有超重人口最多的國(guó)家，而且這個(gè)數(shù)字還在飛速增長(zhǎng)。科研人員發(fā)現(xiàn)[1]肥胖病人患高血壓、高血脂、心腦血管等疾病的概率比一般人要高。肥胖往往和人們攝入過(guò)多高脂、高熱量食物有關(guān)，降低脂肪攝入，可以有效降低體重。人體攝入的脂肪先通過(guò)消化系統(tǒng)中的胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL）水解[1]，然后被吸收轉(zhuǎn)換成能量。在脂肪水解過(guò)程中，胰脂肪酶作為重要的水解酶可以把油脂水解為甘油和單分子脂肪酸[2]，因此抑制或降低體內(nèi)胰脂肪酶的活性可以對(duì)脂肪的水解和吸收進(jìn)行抑制，以此達(dá)到減重和控制肥胖的目的[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種能抑制脂肪酶活性的功能成分，如黃酮類物質(zhì)[4-7]、多酚類物質(zhì)[8-10]、香水蓮花提取物[11]等，但目前還未有綠茶中脂肪酶抑制劑提取的報(bào)道。

國(guó)內(nèi)外對(duì)綠茶的諸多研究表明，綠茶中的活性成分具有調(diào)節(jié)血脂[12-13]和控制肥胖[14-15]等多種保健功能，在嶗山綠茶中提取分離能抑制脂肪酶活性的功能性成分，并優(yōu)化其提取工藝，不但可以改善目前日益嚴(yán)重的人群肥胖問(wèn)題，對(duì)開發(fā)綠茶資源進(jìn)而服務(wù)新舊動(dòng)能轉(zhuǎn)換也具有重大的意義。

超聲波對(duì)生物細(xì)胞有破壞作用[16]，可以強(qiáng)化萃取系統(tǒng)物質(zhì)的傳遞作用，與傳統(tǒng)溶劑法提取工藝相比，能使有效成分更好的溶出[17]。該文對(duì)萃取液施加超聲波，對(duì)超聲波輔助提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的影響因素進(jìn)行探討，并篩選出較佳的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嶗山綠茶：市售，曬干后粉碎，備用；豬胰脂肪酶（酶活≥30 000 U/g）：Sigma公司；硝基苯基月桂酸酯底物溶液（P-nitropenyl laurate，pNPL）：月桂酸 4-硝基苯酯：安徽酷爾生物工程有限公司；pH 7.5磷酸緩沖液（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

LTB-1000數(shù)顯溫控超聲波清洗機(jī)：濟(jì)寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司；RE-2001A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；ZNCL-GS磁力攪拌器：上海一科儀器有限公司；2-16N高速常溫離心機(jī)：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；5202P型數(shù)顯pH計(jì)：登科普瑞（北京）科技有限公司；DNM-9606酶標(biāo)分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胰脂肪酶活性檢測(cè)方法

37℃恒溫下，把底物與胰脂肪酶放置3 min，底物1 min內(nèi)釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位，U。

在試管中加入pH 7.5的磷酸緩沖溶液350 μL、450 μL pNPL底物、樣品溶液 50 μL，37℃預(yù)熱 10 min后加入 150 μL 胰脂肪酶（0.2 mg/mL），混勻，37℃避光反應(yīng)60 min，16 000 r/min離心3 min，取上清于405 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度[18-19]。用緩沖溶液代替樣品液做對(duì)照組做3次平行試驗(yàn)。抑制率按公式（1）進(jìn)行計(jì)算率。

式中：A1、A2分別為對(duì)照組和不同樣品溶液在405 nm處的吸光度。

1.3.2 嶗山綠茶提取物得率的計(jì)算

提取物冷凍干燥后，稱量，按公式（2）計(jì)算提取物的得率。

式中：Y 為提取物得率，%；m′為提取物質(zhì)量，g；m為嶗山綠茶質(zhì)量，g。

1.3.3 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑活性部位篩選

取粉碎后的嶗山綠茶1 kg，按1∶7（g/mL）的料液比加入95%乙醇，浸提3次，每次半小時(shí)。濃縮提取液，按1∶3（g/mL）的料液比分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至有機(jī)層無(wú)色，濃縮并冷凍干燥各有機(jī)相提取物，配成所需濃度后按1.3.1所述方法測(cè)定各極性溶劑提取物的抑酶活性。

1.3.4 超聲波提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的單因素試驗(yàn)

稱取20 g嶗山綠茶6份于燒杯中，置于超聲清洗儀中超聲提取，分別對(duì)乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間等影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，把得到的浸提液進(jìn)行濃縮，再用有機(jī)溶劑萃取，冷凍干燥有機(jī)溶劑萃取液，干燥后的粉末物質(zhì)即為嶗山綠茶中抑制脂肪酶的活性成分[20-21]。

1.3.4.1 乙醇濃度對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比分別加入 20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，30℃下超聲浸提 30 min，超聲波功率為300 W。測(cè)量超聲波下不同濃度乙醇對(duì)提取物的得率和對(duì)脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.2 超聲功率對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，設(shè)不同超聲功率（100、200、300、400、500、600 W）在 30 ℃下提取30 min。測(cè)量不同超聲功率對(duì)提取物的得率和對(duì)脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.3 超聲提取溫度對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以1∶15（g/mL）料液比加入60%乙醇，不同溫度下（20、30、40、50、60、70 ℃）下超聲提取 30 min，超聲功率為300 W。測(cè)量不同提取溫度對(duì)提取物的得率和對(duì)脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.4.4 超聲提取時(shí)間對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

以 1∶15（g/mL）料液比加入 60%乙醇，30℃下超聲提取若干分鐘（10、20、30、40、50、60 min），超聲功率為300 W。測(cè)量不同提取時(shí)間對(duì)提取物的得率和對(duì)脂肪酶活性抑制率的影響。

1.3.5 提取工藝的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脂肪酶抑制劑的得率和抑制率為指標(biāo)，以乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間作為正交試驗(yàn)的考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)，因素和水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1The factors and levels of L9（34）orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑活性部位篩選

不同溶劑提取物對(duì)脂肪酶活性的抑制作用見圖1。

圖1 不同溶劑提取物對(duì)脂肪酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of different solvent extracts on lipase activity

由圖1可見，5種不同極性提取物對(duì)脂肪酶活性的抑制作用從大到小依次為：乙酸乙酯提取物>水相提取物>正丁醇提取物>氯仿提取物>石油醚提取物。其中乙酸乙酯提取物的抑制效果顯著，當(dāng)提取物濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)脂肪酶活性的抑制率可達(dá)89.3%。不同溶劑提取物抑制脂肪酶活性的IC50見表2。

表2 不同溶劑提取物抑制脂肪酶活性的IC50Table 2 IC50of different solvent extracts to inhibit lipase activity

根據(jù)圖1計(jì)算得出不同極性溶劑提取物對(duì)脂肪酶活性的抑酶IC50，如表2所示，乙酸乙酯提取物對(duì)脂肪酶活性的抑制效果最好，石油醚提取物抑制效果最差。因此選擇用乙酸乙酯作為超聲提取脂肪酶抑制劑工藝的萃取劑。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測(cè)量不同濃度乙醇條件下提取物的得率和對(duì)脂肪酶的抑制率見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖2可知，脂肪酶抑制劑的得率隨著乙醇濃度的增加而增加，但當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí)，得率增加不大；脂肪酶抑制劑的抑制率在乙醇濃度為50%時(shí)最大，高于50%時(shí)抑制率反而下降，這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度增加，非抑制成分醇溶物增加，雖然得率增加，但抑制劑含量下降，從而導(dǎo)致抑制率下降。

2.2.2 超聲功率對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測(cè)量不同超聲功率下提取物的得率和對(duì)脂肪酶的抑制率見圖3。

圖3 超聲功率對(duì)脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖3可知，提取物得率和對(duì)脂肪酶的抑制率都在400 W時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)殡S著超聲功率增加，熱效應(yīng)也逐漸加強(qiáng)，脂肪酶抑制劑的活性降低。

2.2.3 超聲提取溫度對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

測(cè)量不同超聲提取溫度下提取物的得率和對(duì)脂肪酶的抑制率見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield and inhibition rate of lipase inhibitors

由圖4可知，提取物得率與提取溫度成正比，而抑制率隨著溫度升高先增加后降低，在40℃時(shí)抑制率最大?？梢?，溫度升高雖然可增加得率，但卻使脂肪酶抑制劑降低了活性。

2.2.4 超聲提取時(shí)間對(duì)脂肪酶抑制劑的得率和抑制率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)提取物的得率和對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率的影響如圖5所示。

由圖5可知，提取率隨時(shí)間不同而不同，如果超聲提取時(shí)間過(guò)短，則有效成分來(lái)不及從綠茶細(xì)胞中溶出，影響提取率，但當(dāng)綠茶中脂肪酶抑制劑基本浸出完畢后，增加提取時(shí)間對(duì)得率影響不大，其抑制率反而有所下降，因?yàn)榛钚猿煞衷谌芤褐虚L(zhǎng)時(shí)間受熱可能使部分結(jié)構(gòu)被破壞。從圖5可以看出超聲提取20 min時(shí)抑制率最大。

圖5 超聲提取時(shí)間對(duì)脂肪酶抑制劑得率和抑制率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on the yield and inhibitory rate of lipase inhibitors

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇濃度、超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間4個(gè)影響提取工藝的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 超聲提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test of ultrasonic extraction of lipase inhibitors from Laoshan green tea

由表3可以看出，影響提取物得率的因素的主次順序?yàn)锳>D>B>C，即乙醇濃度對(duì)得率影響最大，其次是超聲提取時(shí)間，然后是超聲功率和超聲提取溫度。最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即用70%乙醇，超聲波功率為200 W，在50℃下超聲提取30 min。對(duì)于抑制劑抑制率，影響因素的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即乙醇濃度對(duì)抑制率影響最大，其次是超聲提取時(shí)間，然后是超聲功率和超聲提取溫度，最優(yōu)組合為A2B2C1D1，即用60%乙醇，超聲功率為300 W，在30℃下提取10 min。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，確定A2B2C1D1為最終優(yōu)化工藝條件。

2.4 驗(yàn)證優(yōu)化工藝試驗(yàn)

用60%乙醇，設(shè)定超聲功率為300 W，在30℃下超聲提取10 min，以此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑最佳提取工藝條件Table 4 Verification of the optimum conditions for inhibitor

3次驗(yàn)證試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值皆在2%之內(nèi)，說(shuō)明此工藝穩(wěn)定性好。在此工藝條件下，提取物平均得率為29.2%，平均抑制率為79.2%。

3 結(jié)論

用不同極性溶劑對(duì)嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的活性部分進(jìn)行篩選，水、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇組分對(duì)嶗山綠茶中脂肪酶抑制的IC50值分別為3.95、9.64、34.73、0.69、21.61 mg/mL，脂肪酶抑制劑重要集中在乙酸乙酯組分中，因此提取工藝先用乙醇提取，再用乙酸乙酯萃取。經(jīng)綜合評(píng)定，確定超聲波法法提取嶗山綠茶中脂肪酶抑制劑的最佳工藝條件為：用60%乙醇，超聲功率為300 W，在30℃下超聲提取10 min，得率和抑制率分別為29.2%和79.2%。與單純用溶劑浸提相比，超聲波輔助提取工藝提高了脂肪酶抑制劑的得率和抑制率，并大大縮短了提取時(shí)間。