(武漢大學人民醫(yī)院1 感染管理辦公室，2 藥學部，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：zhangwhu@hotmail.com)

炎癥損傷被認為是細胞發(fā)生損傷的重要誘導因素，當細胞處于炎性因子高表達的環(huán)境時，會引起細胞膜受體的激活，從而將胞外信號傳導至胞內以激活炎性或其他損傷信號通路，導致細胞處于炎性損傷狀態(tài)，進一步改變細胞結構的完整性，誘發(fā)細胞凋亡或死亡，導致諸如氧化應激、精神病癥及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[1-2]。槲皮素主要存在于中草藥及蔬果中，屬于天然黃酮類活性物質，在抗炎、抗氧化、抗癌等方面效果顯著[3]；并且其可減輕肝炎、肝硬化所致的肝損傷，還通過誘導P21WAF1/CIP1表達促進肝癌細胞的凋亡[4-5]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)作為硫氧還蛋白的內源性抑制劑，是細胞重要的抗氧化還原蛋白和抗凋亡蛋白[6]。TXNIP被激活后可以誘導NACHT-LRR-PYD結構域蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3，NLRP3)炎性通路活化[7]。有研究表明非酒精性脂肪性肝病患者血清中TXNIP水平顯著高于正常人群，并且其水平與炎癥及胰島素抵抗密切相關[8]。本研究探討槲皮素對脂多糖誘導人肝細胞L02炎性損傷的改善作用，以及其對TXNIP/NLRP3炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人肝細胞(L02)購買于武漢巴菲爾生物有限公司(從美國ATCC細胞庫引進)。

1.2 藥品與試劑 脂多糖(Sigma公司，批號：L2880)；槲皮素(Sigma公司，CAS編號：117-39-5；≥99%)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；上海吉諾公司，批號：30600034)；胎牛血清(Gibco公司，批號：110419)；胰酶(Gibco公司，批號：1220087)；細胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒(日本同仁研究所，批號：WST-8)；白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immumosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢華美生物有限公司，批號：SV30087)；RIPA裂解液(上海吉諾公司，批號：C1325)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號：131221)；二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號P0010S-01)；牛血清白蛋白粉末(武漢谷歌生物有限公司，批號：HB10038)；β肌動蛋白(β-actin，批號：ab1006325)、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS，批號：ab1552141)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX-2，批號：ab2300142)、TXNIP(批號：ab3265217)及NLRP3(批號：ab1230014)一抗(Abcam公司)及二抗羊抗兔IgG(武漢谷歌生物有限公司，批號：SYT30024)。

1.3 儀器 BBS-V8800型單人超凈臺(AIRTECH公司)；CB15C02型細胞培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；Victor3 1420 Multilabel Counter型酶標儀(美國Perkin Elmer公司)；DYCZ-24DN型SDS-PAGE凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；Odyssey型雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR公司)。

1.4 L02細胞培養(yǎng) L02細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清、1% A-A(100 U/ml青霉素-100 U/ml鏈霉素)DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、90%的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長到80%～90%時，用0.25%胰酶-0.125%乙二胺四乙酸消化，待細胞變圓加入新培養(yǎng)基終止消化，并以1 ∶3比例傳代。

1.5 藥物毒性試驗 將L02細胞用NMEM完全培養(yǎng)液重懸后，以1×104個細胞/孔接種于96孔板，待細胞貼壁生長到50%～60%時，取出培養(yǎng)板，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度槲皮素的(0、50、100、200、400、800、1600 μmol/L)稀釋培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37℃、5% CO2、90%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入CCK-8試劑，輕輕震蕩均勻后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，取出置于酶標儀上，于450 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞相對存活率，相對存活率=A實驗組/A對照組。每個濃度設6個復孔。

1.6 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞增殖的影響 按“1.5”的方法接種細胞后，將細胞分為正常對照組、脂多糖誘導組、脂多糖+低劑量(50 μmol/L)槲皮素組、脂多糖+中劑量(100 μmol/L)槲皮素組、脂多糖+高劑量(200 μmol/L)槲皮素組。各濃度槲皮素組中加入相應濃度槲皮素溶液，2 h后除正常對照組外均加入200 μl脂多糖溶液(0.1 μg/ml)。培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育1 h后于酶標儀450 nm波長下測定A值。每組平行試驗設置4個復孔。計算細胞相對存活率。

1.7 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞上清炎性因子水平的影響 將L02細胞用NMEM完全培養(yǎng)液重懸后，以1×105個細胞/孔接種于6孔板，待細胞貼壁生長到50%～60%后，取出培養(yǎng)板，棄去舊培養(yǎng)基，按“1.6”的方法進行分組及藥物處理后，繼續(xù)置于37℃、5% CO2、90%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，收集細胞及上清，4℃下12 000 r/min離心5 min。檢測上清液的炎性因子IL-1β及TNF-α水平，其操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.8 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞相關蛋白表達的影響 將“1.7”中獲得的細胞用RIPA裂解液充分裂解，采用二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度。向蛋白裂解液中加入蛋白上樣緩沖液，于100℃加熱煮沸7 min。每孔加入50 μg蛋白上樣，在10%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離蛋白，分離膠電泳時電壓設置為70 V，濃縮膠電泳分離時電壓設置為120 V；蛋白分離完成后在270 mV電流轉膜90 min；5%脫脂牛奶封閉1 h；分別以β-actin、iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3一抗(稀釋比1 ∶1 000)孵育(4℃)過夜后，用TBST洗膜3次，10 min/次，再二抗(稀釋比1 ∶3 000)室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，10 min/次，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜分析蛋白表達水平。其中以β-actin為內參。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 槲皮素對L02細胞的藥物毒性作用 不同濃度槲皮素干預后L02細胞組間的相對存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同濃度槲皮素干預后L02細胞的相對存活率(x±s，%)

2.2 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞增殖的影響 與正常對照組相比，其他4組L02細胞相對存活率均降低(均P<0.05)；脂多糖誘導組、脂多糖+低劑量槲皮素組、脂多糖+中劑量槲皮素組、脂多糖+高劑量槲皮素組的細胞相對存活率依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 5組L02細胞的相對存活率(x±s，%)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與脂多糖誘導組比較，#P<0.05；與脂多糖+低劑量槲皮素組比較，●P<0.05；與脂多糖+中劑量槲皮素組比較，▲P<0.05。

2.3 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞上清炎性因子水平的影響 脂多糖誘導組L02細胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均高于正常對照組(均P<0.05)；不同劑量槲皮素干預組細胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均低于脂多糖誘導組(均P<0.05)。見表3。

表3 5組L02細胞上清炎性因子水平比較(x±s，pg/ml)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與脂多糖誘導組比較，#P<0.05。

2.4 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞iNOS及COX-2蛋白表達水平的影響 脂多糖誘導組細胞iNOS及COX-2蛋白的相對表達水平均高于正常對照組(均P<0.05)；不同劑量槲皮素干預組細胞iNOS及COX-2蛋白的相對表達水平均低于脂多糖誘導組(均P<0.05)。見表4及圖1。

表4 5組L02細胞相關蛋白相對表達水平比較(x±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與脂多糖誘導組比較，#P<0.05。

圖1 5組細胞炎性蛋白表達情況

注：1、2、3、4、5分別為正常對照組、脂多糖誘導組、脂多糖+低劑量槲皮素組、脂多糖+中劑量槲皮素組、脂多糖+高劑量槲皮素組。

2.5 槲皮素對脂多糖干預后L02細胞TXNIP及NLRP3蛋白表達水平的影響 脂多糖誘導組細胞TXNIP、NLRP3蛋白的相對表達水平均高于正常對照組(均P<0.05)；不同劑量槲皮素干預組細胞TXNIP、NLRP3蛋白相對達水平均低于脂多糖誘導組(均P<0.05)。見表4及圖2。

圖2 5組細胞TXNIP及NLRP3蛋白表達情況

注：1、2、3、4、5分別為正常對照組、脂多糖誘導組、脂多糖+低劑量槲皮素組、脂多糖+中劑量槲皮素組、脂多糖+高劑量槲皮素組。

3 討 論

隨著社會經濟水平的提高，人類飲食結構及生活方式的改變，非酒精性脂肪肝的患病率越來越高，并且發(fā)病呈年輕化趨勢。如果得不到有效的治療，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，其已經成為一種嚴重威脅人類生命健康的疾病[9]。TXNIP又稱為維生素D3上調蛋白，屬于視紫紅質抑制蛋白家族成員，廣泛參與腫瘤、免疫及炎癥反應。近期研究表明TXNIP可以與硫氧還蛋白結合相互作用引發(fā)氧化應激，而且其高表達水平還會誘導炎性通路的激活[10]，且與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[11-12]。槲皮素屬于一種藥理活性較強的天然成分，在多種病理反應中均具有較好的抑制作用。槲皮黃酮不僅對多種致癌劑、促癌劑有拮抗作用，而且可以抑制多種惡性腫瘤細胞的生長；并且槲皮素對人卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞等生長均有較好的抑制作用[13]。本課題組的早期研究結果也表明槲皮素能夠減輕酒精性肝損傷大鼠肝臟組織的炎性及壞死，其主要通過降低內毒素水平、抑制庫普弗細胞活化和下調促炎細胞因子表達實現(xiàn)[14]，并可降低高同型半胱氨酸水平及氧化應激[15]；此外槲皮素能通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路改善肝纖維化[16]。

本研究采用脂多糖體外誘導建立L02細胞炎性損傷模型，結果顯示脂多糖誘導組的L02細胞相對存活率低于正常對照組(均P<0.05)，且炎癥因子(IL-6、IL-1β 及TNF-α)、炎性蛋白(iNOS、COX-2)及炎性通路相關蛋白(TXNIP及NLRP3)水平均高于正常對照組(均P<0.05)，即脂多糖可抑制L02細胞的增殖，刺激炎性因子及炎性蛋白的高表達，高度活化炎性信號通路，提示L02細胞炎性損傷模型構建成功。采用槲皮素干預L02細胞后發(fā)現(xiàn)，不同濃度槲皮素干預組間L02細胞的相對存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示槲皮素對L02細胞沒有毒性作用。我們進一步觀察槲皮素對脂多糖干預后L02細胞增殖、炎癥因子及相關蛋白表達情況的影響，結果顯示，脂多糖誘導組、脂多糖+低劑量槲皮素組、脂多糖+中劑量槲皮素組、脂多糖+高劑量槲皮素組的細胞相對存活率依次升高(均P<0.05)，提示槲皮素可改善脂多糖所致的細胞損傷，且呈濃度依賴性。此外，不同劑量槲皮素干預組IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3水平均低于脂多糖誘導組(均P<0.05)，這提示槲皮素可以抑制L02細胞中炎性因子及蛋白的表達，并抑制TXNIP/NLRP3炎性信號通路的活化。

綜上所述，槲皮素可以改善脂多糖誘導的L02細胞的炎性損傷，其可能通過降低TXNIP/NLRP3通路的活性發(fā)揮作用。